WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Касаткина Арина Николаевна

Зерновая дробина как основа для получения биологически

активных добавок с пробиотическими свойствами

Специальность: 03.00.23. – Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание

ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена на кафедре биотехнологии инженерного экологического факультета Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Градова Нина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Громовых Татьяна Ильинична доктор технических наук Иванова Людмила Афанасьевна

Ведущая организация: ОАО Государственный научноисследовательский институт биосинтеза белковых веществ Федерального агентства по управлению Федеральным имуществом (ФГУП ГОСНИИ Синтезбелок)

Защита состоится 2 декабря 2008 г. в 15.00 часов на заседании диссертационного Совета ДМ 212.204.13 при Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева по адресу: 125047, г. Москва, Миусская пл., д.9, тел. (499) 978-74-66, факс (499) 978

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им.

Д.И. Менделеева

Автореферат разослан «_»_2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка способов получения биологически активных соединений и белково-углеводных кормовых продуктов из целлюлозосодержащих материалов является одним из актуальных направлений развития современной биотехнологии.

Опыт, накопленный в России, показывает эффективность использования методов микробиологического синтеза для решения проблемы обеспечения животноводства высокоценным белком при использовании в качестве сырья целлюлозосодержащих отходов сельского хозяйства, лесной, деревообрабатывающей, пищевой промышленности и др. [Л.К.

Эрнст, 1988].

К настоящему времени разработан ряд биотехнологических способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на предварительном их гидролизе с последующим глубинным, поверхностным, твердофазным или гетерофазным культивированием микроорганизмов [В.И. Шарков и др., 1973; В.А. Быков, Ф.А. Прищепов, 1985; Е.Г.

Борисенко и др., 2003; В.И. Панфилов, 2004].

Широкое использование антибиотических и других фармацевтических средств в настоящий период развития человечества в условиях напряженного состояния окружающей среды обусловило важность использования пробиотических препаратов для сохранения здоровья человека. Большое внимание исследователей и практиков уделяется получению пробиотических продуктов для животноводства, что связано, в первую очередь, с проблемами отечественного кормопроизводства. В последние годы структура фуражных кормов в стране претерпела значительные изменения, которые привели к вынужденному введению в комбикорма трудно перевариваемых и низкокалорийных компонентов (отруби, рожь, овес, ячмень, просо, пивная дробина и др.). При этом отрицательное влияние на биологическую ценность фуражных кормов оказывает также использование в их составе белков, в основном, растительного происхождения (соевый, подсолнечный и рапсовый шроты, горох и др.), что приводит к увеличению доли трудно перевариваемых компонентов в кормах [Э.В. Удалова и др., 2004]. Разработка способов повышения степени усвояемости этих компонентов – одна из важных биотехнологических задач.

Одним из промышленных крупномасштабных трудноусвояемых целлюлозосодержащих отходов является зерновая дробина – отходы пивоваренного и спиртового производства (до 35 млн. т/год в РФ), которые в настоящее время направляются либо на очистные сооружения, либо сливаются на поля орошения и в водоемы, что наносит экологический ущерб окружающей среде.

Дробина в нативном состоянии не является биологически ценным кормовым продуктом, так как в ее составе преобладают целлюлоза, гемицеллюлозы и трудноперевариваемый протеин. Она является источником лишь ряда питательных веществ, в частности, углеводов и минеральных веществ. Однако дробина не обладает токсичными свойствами, что, несмотря на ее низкую усвояемость и биологическую ценность, определяет возможность ее непосредственного использования в кормовых целях [И. Егоров и др., 2006; Е.

Калошина и др., 2006; В. Двалишвили и др., 2007].

Анализ литературы, касающийся исследований и разработки способов повышения биологической ценности зерновой дробины, показывает, что эффективность биотехнологических способов получения биологически активных кормовых добавок на ее основе может быть повышена за счет совершенствования способов биоконверсии целлюлозосодержащих компонентов сырья и биосинтетической активности культивируемых на гидролизатах микроорганизмов.

Целью настоящей работы явилось исследование способов получения белковоуглеводной кормовой добавки с пробиотическими свойствами на основе зерновой дробины.

В задачи работы входило:

- изучение гидролиза зерновой дробины при использовании нативных целлюлолитических ферментов микроорганизмов и промышленных мультиэнзимных композиций;

- разработка режимов гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины с целью получения белково-углеводной кормовой добавки и добавки, обогащенной селеном и йодом;

- твердофазное культивирование бактерий рода Bacillus на зерновой дробине;

- культивирование молочнокислых бактерий и их ассоциаций на нативной дробине и ее ферментолизатах;

- исследование возможных способов получения БАД, обладающих пробиотическими свойствами.

Научная новизна результатов исследований. Исследована возможность получения БАД с различными функциональными свойствами (белково-углеводная добавка, белковоуглеводная добавка, обогащенная селеном и йодом и белково-углеводная добавка, обладающая пробиотическими свойствами) на основе зерновой дробины при культивировании дрожжей и молочнокислых бактерий. Впервые изучено влияние культуральной жидкости гриба Trichoderma viride, целевых мультиэнзимных композиций и бактерий рода Bacillus на ферментативную деструкцию зерновой дробины. Исследовано стабилизирующее действие химических аналогов факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолов – на комплекс ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции. Исследован углеводный состав ферментативных гидролизатов дробины, показано, что наибольшую долю углеводов составляют пентозы. Впервые показан активный рост молочнокислых микроорганизмов на ферментолизатах дробины, обогащенных автолизатом предварительно культивируемых микроорганизмов (дрожжей, грибов и бактерий). Показана наибольшая активность инокулята ассоциативных культур кефирных грибков при культивировании на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Практическая значимость. Разработаны технологические режимы переработки зерновой дробины - отходов пивоваренного производства – для получения белковоуглеводной кормовой добавки, исследованы двухстадийные процессы культивирования дрожжей и молочнокислых культур на ферментолизатах дробины, включающих стадию автолиза дрожжевых клеток, а также показана возможность переработки дробины в анаэробных условиях при использовании штамма бактерий Bacillus cereus БП-46, обладающего целлюлолитической активностью.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждены на Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производство-технологииэкология» (Киров, 2006); на IV съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Пущино, 2006); на VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». (Москва, 2007.); и Российской школе–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию института ГосНИИгенетика (Москва – Пущино, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 48 таблиц и 33 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы и 4 глав экспериментальных исследований. Список литературы включает 168 источников, из них 38 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель и задачи исследований.

В первой главе представлен систематизированный обзор научно-технической, нормативной и патентной литературы, в котором представлена характеристика возможных способов переработки зерновой дробины, рассмотрены способы биодеградации целлюлозосодержащего сырья и повышения биологической ценности.

Во второй главе описаны экспериментальные методы исследований и даны характеристики объектов исследований. Для выполнения экспериментальной части использовались стандартные методы испытания и современные приборы и оборудование.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали отходы пивоваренного производства – нативную зерновую дробину (влажность 80-90%) и измельченную воздушно-сухую (влажность 10%), предоставленные, соответственно, Очаковским пивоваренным заводом и частной пивоварней «Wienen Bier».

В работе использовали штамм дрожжей Yarrowia lipolytica, любезно предоставленный Звягильской Р.А., штамм гриба Trichoderma viride из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, штамм Bacillus cereus БП-46, выделенный Ушаковой Н.А.

из слепой кишки большой полевки (институт проблем экологии и эволюции животных им.

А.Н. Северцова РАН); штаммы молочнокислых микроорганизмов Lactobacillus casei– B 7657, Lactobacillus acidophilus – AT-41, Lactococcus lactis ТБ2 из коллекции института эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского и из института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, кефирные грибки, используемые для приготовления заквасок на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, а также неидентифицированные молочнокислые бактерии, растущие на глюкозе, выделенные из кефирных грибков;

штамм условно-патогенной культуры Staphylococcus aureus из коллекции кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева, а также культуру инфузории Tetrahymena pyriformis, предоставленную Долговым В.А. (Институт ветеринарной санитарии).

Определение химического состава зерновой дробины и полученных на ее основе продуктов проводили по гостированным методикам: влажность [ГОСТ 1396.3сырой» протеин [ГОСТ 1396.4(2874-89)]; «сырая» клетчатка [ГОСТ 1396.2-91]; «сырая» зола [ГОСТ 26226-95]; содержание безазотистых экстрактивных веществ - расчетным методом. Для определения первоначальной влажности, сырого протеина и сырой клетчатки использовали также метод ИК-спектроскопии (ближняя область инфракрасного спектра). Определение проводили на ИК-анализаторе, модель 4500, Aptek, США-Россия.

Микотоксины в исходном сырье и конечных продуктах анализировали с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа RIDASCREEN® FAST, R-Biopharm, Германия.

Ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства ввиду гетерофазности процесса осуществляли при перемешивании 80-100 об/мин, t - 50±0,5°С, рН среды – 5,0-5,5, время экспозиции – 2 часа. В качестве ферментных препаратов применяли культуральную жидкость гриба Trichoderma viride, а также мультиэнзимные композиции Ф-ПДФ-ПД-2 и Ф-ПД-3, разработанные НТЦ «Лекарства и биотехнология».

Ферментативную активность определяли согласно стандартным методикам: целлюлолитическая активность [ТУ 9291-036-3458871-2001]; ксиланазная активность [ТУ 9291глюканазная активность [ТУ 9291-034-34588571-2001]; протеолитическая активность [ГОСТ 20264.2-88]; амилолитическая активность [ГОСТ 20264.4-89];

эндоглюканазная активность – вискозиметрический метод в модификации [А.П. Синицын и др., 1995].

При изучении стабилизации мультиэнзимных композиций использовали химические аналоги факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолы (АОБ) – С7 и С12-соединения (Sigma), степень очистки С7 – 0,8; С12 – 0,9999, предоставленные институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.

Определение углеводного состава ферментолизатов пивной дробины проводили методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil» (РФ), ТУ 26–11–17–89. Количественный состав углеводов оценивали на денситометре «Sorbfil», (Россия), ТУ 4436Грибы и дрожжи культивировали в глубинных гетерофазных условиях в колбах объемом 250 и 750 см3 при 100 и 500 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180-200 об/мин.) при 30-32°С и 28-30°С, соответственно; молочнокислые микроорганизмы - в анаэробных условиях при 37,5±0,20С в пробирках объемом 30 см3 и в колбах объемом 50 и 250 см3 при 20, 30, 100 и 150 см3 питательной среды, соответственно; бациллы – в колбах объемом 250 см3 при 100 и 150 см3 питательной среды при инкубировании на качалке (180-200 об./мин) при 29-300С.

Твердофазное культивирование грибов осуществляли при температуре 300С в течение 5-ти суток в лабораторном реакторе, оснащенном компрессором, обеспечивающим расход воздуха через стерильный воздушный фильтр до 2,4 л/мин. Твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 – в колбах объемом 500 и 750 см3 при 70-75%ном заполнении в течение 48 часов при температуре 30±1°С в микроаэрофильных условиях.

Автолиз дрожжей проводили в течение 12 часов при 400С в анаэробных условиях.

Для автолиза грибов использовали модифицированный метод [Аладашвили Н.В. с соавт., 1991] с добавлением этилового спирта в концентрациях от 1,0 до 3,0%, при 550С продолжительность экспозиции составляла 23 часа. Продукт после твердофазного культивирования бацилл на зерновой дробине в течение 24 часов выдерживали при температуре 550С в анаэробных условиях, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеиновую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова, 1990 г.].

Молочную кислоту определяли методом Баркера-Саммерсона [S.B. Barker and William H. Summerson, 1940]; восстанавливающие сахара – модифицированным методом Шомоди-Нельсона и фенол-сернокислым методом Дюбуа [А.П. Синицын и др., 1995].

Уровень содержания селена и йода в кормовых добавках определяли методом спектрофотовольтометрии, Р.4.1.1672-03 «Руководство по методам и анализам БАВ в пище».

Острую токсичность полученных кормовых добавок определяли на тест-объекте инфузории Tetrahymena pyriformis [ГОСТ 28178-89].

Пробиотическую активность бацилл и молочнокислых культур характеризовали на основании их устойчивости к температуре 60-650С, к желчи, ферментам пищеварительного тракта, поваренной соли (NaCl), фенолу, к щелочной реакции среды [Л.А. Банникова, 1975, Ж.К. Тулемисова, 2002].

Антагонистические свойства продуктов в отношении патогенных культур определяли методом диффузии в агаризованные среды МПА, ГПС и MRS [Н.С. Егоров, 1986, Ж.К.

Тулемисова, 2002].

Оценку симбиотических свойств штамма Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур проводили при их совместном культивировании на твердых питательных средах ГПС и MRS.

Идентификацию штамма Bacillus cereus БП-46 проводили методом мультисубстратного тестирования (МСТ) при использовании системы МСТ «ЭКОЛОГ» [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005]. Регистрацию данных МСТ при использовании программноаппаратного комплекса ЭКОЛОГ (автор–М. В. Горленко). Для математической обработки данных МСТ использовали статистические пакеты STATISTICA.

Статическую обработку результатов проводили на ПК с помощью пакета статистических программ Microsoft Office Excel 2003.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В третьей главе представлены результаты исследований ферментативных гидролизатов зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных биологически активных кормовых добавок.

Зерновая дробина - отход пивоваренных и спиртовых производств - представляет собой нерастворимые оболочки зерна.

Химический состав исследованных образцов дробины Очаковского пивоваренного завода и частной пивоварни «Wienen Bier» показывает незначительное различие по содержанию «сырой» клетчатки и «сырого» протеина: 19,0 и 18,0% а.с.в. и 25,0 и 21,0% а.с.в., соответственно (таблица 1). Высокое содержание клетчатки в дробине до 19,0% и лигнина до 10,0% обосновывает необходимость использования комплекса гидролитических ферментов для ее деструкции и возможность использования данного сырья для получения белково-углеводных кормовых добавок с различными функциональными свойствами.

Отходы Очаковского пивоваренного завода Отходы частной пивоварни 21,0±0,23 18,0±0,18 3,5±0,12 5,1±0,10 9,5±0,23 42,9±0, «Wienen Bier»

Предподготовка зерновой дробины как основы для получения белково-углеводных кормовых БАД включала стадии ее сушки (до остаточной влажности 7-8%), измельчения (1,5-2,0 мм), суспендирования и ферментативной обработки. При изучении реологических свойств водной суспензии измельченной дробины было показано хорошее перемешивание суспензии при содержании сырья 10% (масс.). Все дальнейшие исследования проводили при 10%-ной концентрации зерновой дробины в суспензии, при этом в водной фазе определялось до 8,0 г/л легко экстрагируемых редуцирующих веществ (РВ).

Ферментативную деструкцию зерновой дробины изучали при использовании нативных целлюлитических ферментов грибов рода Trichoderma и бактерий рода Bacillus, а также промышленных мультиэнзимных композиций.

Было исследовано влияние характера посевного материала гриба Tr. viride (споры и вегетативные клетки) на его рост и целлюлолитическую активность при развитии на зерновой дробине в глубинной и поверхностной культуре. Показано, что на измельченной дробине (15,-2,0 мм) в качестве инокулята могут быть использованы обе формы посевного материала, на нативной дробине – только вегетативные клетки.

Поскольку ферменты целлюлазного комплекса являются индуцибельными, было изучено влияние различных индукторов на целлюлолитическую активность гриба Tr.

viride. Показано, что измельченная зерновая дробина наряду с такими известными индукторами, как свекловичный жом, пшеничные отруби, кристаллическая целлюлоза и лактоза, также является эффективным индуктором целлюлаз.

На третьи сутки культивирования в глубинной культуре целлюлазная активность гриба составляла около 25,0 ед./мл, при твердофазном культивировании – 19,0 ед./мл.

При исследовании ингибирования целлюлолитической активности Tr. viride продуктами гидролиза дробины установлено, что ферментативная активность гриба снижалась при дополнительном внесении глюкозы с систему в концентрациях выше 0,4%, что обосновывает целесообразность ассимилирования редуцирующих веществ, образующихся при гидролизе зерновой дробины, другими организмами для повышения активности роста гриба и его целлюлолитической активности на дробине.

Поскольку при культивировании грибов на целлюлозосодержащих субстратах целлюлолитические ферменты секретируются ими непосредственно в культуральную жидкость (КЖ), была исследована возможность использования культуральной жидкости гриба Tr.viride в качестве ферментного препарата для гидролиза зерновой дробины.

Культуральная жидкость была получена при культивировании гриба на измельченной дробине Tr.viride, целлюлолитическая активность которой составляла около 25, ед./мл.

Для ферментативной обработки дробины культуральную жидкость стандартизовали, предварительно разбавляя ее таким образом, чтобы на 1 г дробины приходилось не более единиц целлюлолитической активности. Клетки гриба от КЖ не отделяли.

Была изучена динамика накопления редуцирующих сахаров в зависимости от соотношения «фермент-субстрат» (количество гидролизуемой дробины составило 1,0; 2,0; 3,0;

4,0; 5,0; 10,0; 15,0 и 20,0%) и продолжительность ферментолиза. Гидролиз проводили при t =500С, pH=5,0 и интенсивности перемешивания 80-100 об/мин.

10, РВ, г/л Рис.1. Динамика накопления редуцируюснижалось, в среднем, на 6,0% (с 19,0 до щих сахаров при ферментолизе дробины культуа.с.в.).

ральной жидкостью гриба Tr.viride При экспозиции реакционной среды свыше 120 минут концентрация РВ оставалась на постоянном уровне во всех вариантах опыта.

Таким образом, в качестве оптимального режима ферментативного гидролиза дробины культуральной жидкостью гриба Tr.viride может быть рекомендован следующий: 10%ная суспензия дробины, целлюлолитическая активность КЖ – 10 единиц на 1 г дробины, время экспозиции 120-150 минут, перемешивание 80-100 об/мин., рН 5,0 и t=500C.

Для повышения степени конверсии зерновой дробины проводили твердофазное культивирование гриба Tr.viride на измельченной дробине (размер частиц 45 мм) в лабораторном реакторе в стерильных условиях при высоте слоя дробины 60 мм, t = 300С, рН 4,5, влажности среды 55-60% и аэрации. Каждые 12 часов субстрат увлажняли стерильным раствором минеральных солей, отводя тем самым и продукты гидролиза дробины, способных репрессировать активность целлюлолитических ферментов гриба. Культивирование проводили до начала споруляции культуры (до образования воздушного мицелия над поверхностью субстрата).

Для повышения содержания усвояемого белка в полученном продукте биомассу выросшего на дробине гриба Tr. viride подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу выдерживали в течение 23 часов при t=550C, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза этиловый спирт в концентрации 1,0; 2,0 и 3,0%.

Полученные в результате исследований данные показали, что при поверхностном культивировании Tr. viride на дробине и последующем автолизе содержание протеина в твердой фазе повышалось до 29,0%. По сравнению с контрольным образцом содержание «сырого» протеина при добавлении на стадии автолиза этилового спирта в концентрациях 1,0, 2,0 и 3,0% (об.) повышалось, соответственно, с 25,0% до 25,5, 27,0 и 29,0% а.с.в. Причем, дальнейшее повышение концентрации этанола в среде нецелесообразно, поскольку при выделении продуктов для использования их в качестве кормовых или пищевых добавок (с точки зрения их безвредности) предпочтительнее автолиз проводить в присутствии этанола в концентрации не более 3 %.

Таким образом, при поверхностном культивировании грибов на дробине возможно получение белково-углеводного продукта, содержащего не более 13,0% «сырой» клетчатки и не менее 29,0% «сырого» протеина.

Анализ содержания микотоксинов в полученных ферментолизатах показал, что концентрация афлатоксина В1 определялась на порядок ниже его ПДК.

Биодеградация зерновой дробины бактериями рода Bacillus В работах Ушаковой Н.А. [2004, 2006] была показана способность ферментативного расщепления целлюлозы бактериями, выделенными из слепой кишки травоядных животных, где они выполняют роль, аналогичную биоценозу рубца жвачных животных, то есть обладают целлюлолитической и пробиотической активностью.

Один из штаммов бактерий р. Bacillus БП-46 выделенных из слепой кишки большой полевки Microtus fortis, первично идентифицированный как Bacillus subtilis, был любезно предоставлен нам для исследований Н.А. Ушаковой.

Методом мультисубстратного тестирования, основанном на анализе спектров потребляемых субстратов [М.В. Горленко, П.А. Кожевин, 2005], было показано, что Bacillus БП-46 является представителем вида B.cereus. Принадлежность данного штамма к виду cereus также была подтверждена данными филогенетического анализа.

Изучение физиолого-биохимических свойств B.cereus БП-46 показало, что для роста данного микроорганизма как в аэробных условиях, так и в анаэробных требуются источники органического азота. Штамм является спорулирующим. Исследования ферментативной активности бацилл показали, что Bacillus cereus БП-46 является активным продуцентом протеолитических (110 ед./мл) и целлюлолитических ферментов (18,9 ед./мл), что определяет потенциальную возможность его использования для деструкции зерновой дробины.

Учитывая условия природного местообитания бацилл, был разработан микроаэробный твердофазный способ культивирования бациллы, имитирующий природные условия ее жизнедеятельности (нейтральное значение рН, влажность 55-60%, размеры твердых частиц не более 1 мм, анаэробные условия). Для этого культуральную жидкость выращенной аэробно в жидкой питательной среде B.cereus БП-46 смешивали с равным количеством сухой стерильной дробины. Массу 55%-влажности помещали в микроаэрофильные условия и инкубировали 48 часов при 29-300С.

По окончании ферментации клетки бацилл подвергали автолизу. Для этого гетерогенную массу, содержащую непрогидролизованную зерновую дробину и клетки B. cereus БП-46, выдерживали в течение 24 часов при температуре 550С в условиях затрудненного доступа кислорода, используя в качестве мембранотропного индуктора автолиза олеиновую кислоту в концентрации 0,3% (масс.) [О.В. Кислухина, К.А. Калунянц, Д.Ж. Аленова, 1990 г.].

Содержание «сырого» протеина в полученном продукте определялось на уровне 34,5% а.с.в., «сырая» клетчатка снижалась на 12,5% (с 18,0 до 7,5% а.с.в.) Таким образом, была показана возможность твердофазного культивирования Bacillus cereus БП-46 на зерновой дробине, повышение ее биологической ценности и получения кормового продукта, содержащего «сырого» протеина не менее 34,0%, «сырой» клетчатки не более 8,0%.

Полученный продукт обладал основными пробиотическими свойствами: был устойчив к температуре в диапазоне 60-650С, в щелочной среде до рН 9,6, к действию желчи и пищеварительных ферментов.

Деструкция зерновой дробины мультиэнзимными композициями Для более эффективной конверсии дробины были проведены исследования по изучению ферментативного гидролиза указанного сырья с применением новых комплексных ферментных препаратов (Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3). Характеристика мультиэнзимных композиций (МЭК) представлена в таблице 2.

Выбор ферментов, входящих в состав мультиэнзимных композиций, был обусловлен присутствием в трудногидролизуемой зерновой дробине природных полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз типа ксиланов, арабиноксиланов, прочно связанных с целлюлозой, нерастворимого протеина, а также следовых количеств непрогидролизованного -глюкана.

Качественный и количественный состав Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД- При определении оптимальных условий ферментативной обработки исследуемого сырья показано, что оптимальными условиями ферментолиза дробины мультиэнзимными композициями являются: диапазон рН 5,0-5,5, температура – 500С, интенсивность перемешивания 80-100 об./мин., время экспозиции 2 часа.

Подбор фермент-субстратного соотношения проводили следующим образом: для ферментолиза были подготовлены водные суспензии дробины при гидромодуле от 1,0 до 15,0% при концентрациях мультиэнзимного препарата Ф-ПД-1 0,1 и 1,0% (масс.) (табл. 3).

Прирост РВ* (г/л) при разных соотношениях дробины и препарата Ф-ПД- Концентрация дробины, % Концентрация Ф-ПД-1, % (масс.) Показано, что максимальный выход редуцирующих сахаров, 15,3 г/л наблюдался при обработке 10%-ной суспензии дробины 1%-ным раствором Ф-ПД-1. Отмечено, что при введении препарата в дозе 0,1% уровень прироста редуцирующих сахаров (11,4 г/л) оказался достаточно высоким, и повышение дозы ферментного препарата до 1,0% не обеспечивало адекватного прироста сахаров. Дальнейшее увеличение концентрации субстрата до 15% и выше, приводило к заметному снижению прироста сахаров на 16,0–54,0%, что было связано с затруднением процесса перемешивания вследствие повышения вязкости среды и ухудшением массообменных характеристик в инкубируемой системе.

Все дальнейшие исследования ферментативного гидролиза препаратом Ф-ПД-1 проводили с использованием 10 %-ной суспензии дробины.

Также изучали влияние избыточных концентраций мультиэнзимного препарата на прирост редуцирующих сахаров, образующихся при ферментативном гидролизе дробины, и на содержание «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе прогидролизованного сырья. Для этого были использованы следующие концентрации Ф-ПД-1: 0,1; 0,5;

1,0; 2,0; 4,0 и 5,0%.

Эффективность гидролитического воздействия разных концентраций Ф-ПД-1 на дробину Концентрация Содержание РВ* Прирост РВ, «Сырая» клет- «Сырой» проФ-ПД-1, % после гидролиза, г/л чатка, % а.с.в. теин, % а.с.в.

(масс.) *Содержание легко экстрагируемых РВ до гидролиза (без фермента) в 10%-ной суспензии дробины составляло 8,0 г/л При введении в реакционную смесь как низких концентраций препарата Ф-ПД- (0,05–0,1%), так и избыточных (1,0–5,0%) в инкубируемой среде не отмечено существенного накопления РВ (табл. 4). «Сырая» клетчатка под воздействием ферментов гидролизовалась лишь на 3,0% при введении 0,1% Ф-ПД-1, и степень ее конверсии не возрастала при введении повышенных концентраций фермента. Аналогичная тенденция наблюдалась и по содержанию нерастворимого «сырого» протеина – снижение на 2,0 – 3,0%.

Таким образом, было показано, что оптимальным фермент-субстратным соотношением является 0,1 % Ф-ПД-1 и 10%-ная суспензия зерновой дробины. При этом суммарная концентрация РВ в гидролизате определялась на уровне 12,3 г/л.

Для снижения расхода ферментов на единицу сырья при сохранении высокой степени биоконверсии зерновой дробины были испытаны мультиэнзимные препараты Ф-ПД- и Ф-ПД-3, отличающиеся от Ф-ПД-1 более высоким уровнем содержания целлюлазы и протеазы в мультисистемах, соответственно (табл. 5). В связи с этим доза вводимых препаратов составляла 0,05; 0,075 и 0,1% (масс.).

Показатели гидролитического воздействия мультиэнзимных композиций Ф-ПД-2 и Ф-ПД- Прирост РВ*, г/л 27,0±0,15 30,0±0,25 33,5±0,22 28,5±0,26 30,5±0,25 35,0±0, «Сырая» клетчат- 16,8±0,21 13,4±0,19 10,5±0,25 17,4±0,22 14,2±0,19 9,5±0, ка, % а.с.в.

«Сырой» проте- 23,0±0,16 19,8±0,24 18,0±0,25 21,8±0,23 18,6±0,20 15,0±0, ин, % а.с.в.

*Без учета начальной концентрации легко экстрагируемых редуцирующих веществ в 10%ной суспензии дробины – 8 г/л.

Показано, что оптимальным соотношением фермент-субстратного комплекса для ферментативного гидролиза дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 также является 10%ная суспензия зерновой дробины и 0,1%-ный раствор мультиэнзимной композиции. Прирост редуцирующих сахаров при гидролизе дробины препаратами Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3 составил, соответственно, 25,5 и 27,0 г/л (табл. 5).

«Сырая» клетчатка при действии Ф-ПД-2 в дозе 0,05-0,1% уменьшалась с 19,0 до 16,8-10,5% а.с.в. Также отмечено наибольшее снижение уровня «сырого» протеина с 25, до 15,0% при действии препарата Ф-ПД-3 в дозе 0,1%, содержащего в своем составе протеазу.

Таким образом, первичная оценка мультиэнзимных препаратов Ф-ПД-2 и Ф-ПД- выявила преимущество Ф-ПД-3, под действием которого осуществлялся более эффективный гидролиз «сырого» протеина, и отмечена тенденция к повышению выхода РВ и разрушения «сырой» клетчатки по сравнению с другими МЭК.

Сравнение эффективности гидролитического воздействия мультиэнзимных препаратов (масс.) *Включая начальное содержание легко экстрагируемых РВ в 10%-ной суспензии дробины - 8,0 г/л **Исходное содержание «сырой» клетчатки в дробине 19%, «сырого» протеина - 25%.

В результате проведенных исследований, было показано, что мультиэнзимные препараты по-разному воздействуют на структурные компоненты зерновой дробины (табл. 6).

Так, прирост РВ составил от 12,5 до 27,6 г/л, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 3,0 – 10,0%, «сырой» протеин – на 5,0 – 10,0%. При этом показано, что по сравнению с препаратами Ф-ПД-1 и Ф-ПД-2, более эффективным гидролизующим агентом являлся мультиэнзимный препарат Ф-ПД-3, поскольку он способствовал деградации целлюлозных компонентов дробины, в среднем, на 19,0–47,0% и белка – на 16,7–28,6%, присутствие протеазы в составе Ф-ПД-3 обеспечивало более глубокую конверсию нерастворимого протеина зерновой дробины.

При изучении углеводного состава ферментолизатов дробины методом тонкослойной хроматографии показано, что в их состав входят пентозы, гексозы, дезоксигексозы, представленные L-рамнозой, и ряд олигосахаридов. Доля пентоз в гидролизатах составляла 45,0–47,0%, гексоз – 40,0–45,0% и 13,0–20,0% - смесь поли - и олигосахаридов (табл. 7).

Фракционный состав углеводов в ферментолизатах дробины, % (масс.) Ф-ПД-2 20,0±0,49 25,0±0,38 10,0±0,25 5,0±0,11 5,0±0,13 15,0±0,31 20,0±0, Ф-ПД-3 22,0±0,51 25,0±0,44 12,0±0,22 7,0±0,12 8,0±0,12 13,0±0,27, 13,0±0, Результаты определения углеводного состава показывали, что ферментолизаты зерновой дробины могут быть использованы в качестве питательной основы для культивирования дрожжей и молочнокислых микроорганизмов для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами, предназначенных для кормления сельскохозяйственных животных.

Известно, что одним из эффективных способов стабилизации ферментов является воздействие низкомолекулярных соединений фенольной природы - алкилоксибензолов, синтезирующихся в фазе роста развивающейся микробной культуры.

Исходя из литературных данных, исследовали влияние факторов микробного анабиоза на стабильность ферментов, входящих в состав мультиэнзимной композиции Ф-ПДпри ферментативном гидролизе зерновой дробины.

- прединкубационный способ внесения АОБ в реакционную смесь, когда исследуемые гомологи – С7-АОБ в течение 30 минут и С12-АОБ в течение 60 минут – раздельно выдерживали в растворе с ферментом или с субстратом и затем проводили ферментативный гидролиз.

Ферментативная активность, % ферментами мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 не обуславливало стимуляцию их каталитической активности, при более высоких концентрациях гомолога (выше 0,05 мг/см3) вызывало ингибирование, при этом способ внесения АОБ не влиял на характер изменения По результатам проведенных исследований в качестве лучшего стабилизатора ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 был выбран гомолог С7АОБ при дозе внесения 1,0 мг/см3 и времени прединкубации с Ф-ПД-3 30 минут.

Таким образом, на основании проведенных исследований была показана возможность биодеструкции зерновой дробины под действием ферментов, продуцируемых грибом Trichoderma viride, бактериями Bacillus cereus БП-46 и промышленными мультиэнзимными композициями. Редуцирующие вещества, содержащиеся в гидролизатах дробины на уровне 35,0-40 г/л, могут быть использованы другими микроорганизмами, обеспечивающими получение БАД с функциональными свойствами, что и явилось целью исследований, проводимых на последующих этапах работы.

В четвертой главе представлены результаты гетерофазного культивирования микроорганизмов на ферментативных гидролизатах зерновой дробины.

Гетерофазное культивирование дрожжей на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Получение белково-углеводного продукта и продукта, обогащенного микроэлементами селеном и йодом Для обогащения ферментолизатов дробины микробным белком был исследован рост апатогенного штамма дрожжей Yarrowia lipolytica, способного усваивать широкий спектр источников углерода, активность роста на гидролизатах растительного сырья которого была показана ранее [Е.Б. Цугкиева, 2007].

Дрожжи выращивали на ферментолизатах зерновой дробины в режиме глубинного гетерофазного культивирования. Для этого 10%-ная водная суспензия сырья обрабатывалась культуральной жидкостью гриба Trichoderma viride из расчета 10 ед. целлюлолитической активности на 1 г дробины, или мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата в результате ферментативного гидролиза в среде определялись РВ 16,5 и 35,0 г/л при обработке культуральной жидкостью Tr. viride и Ф-ПД-3, соответственно. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «П» и инокулят дрожжей Y. lipolytica в количестве 2,0х106 кл/мл.

Дрожжи культивировали в периодическом режиме до начала стационарной фазы в ферментере (Vобщ.=2 л) при t = 30-320С, рН 5,0, при перемешивании 500 об/мин и аэрации.

Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей на ферментолизатах дробины представлены в таблице 8.

Твердая фаза после отстаивания отделялась методом декантации, промывалась и подвергалась термолизу (750С, 30 мин.). Полученный продукт сушили при t=500C до остаточной влажности 7-8%.

В процессе гетерофазного культивирования потребление дрожжами редуцирующих веществ составило 85,0-87,0%, прирост дрожжевых клеток 2,5-4,0 х108 кл/мл. Содержание «сырого» протеина в белково-углеводном продукте увеличилось на 8,0-11,0% и составило 29,0-32,0% а.с.в., а содержание «сырой» клетчатки снизилось на 4,0-9,5% и составило 9,5а.с.в.

Показатели гетерофазного глубинного культивирования дрожжей Y.lipolytica на Концентрация РВ, г/л:

Таким образом, при гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Y.lipolytica на ферментативных гидролизатах дробины, полученных как при использовании культуральной жидкости гриба Tr. viride, так и МЭК Ф-ПД-3, показана возможность получения белково-углеводного продукта.

Для повышения биологической ценности полученного белково-углеводного продукта была исследована возможность его обогащения такими микроэлементами, как селен и йод.

Для обогащения селеном перед началом культивирования дрожжей в среду, содержащую ферментативный гидролизат дробины и минеральные соли, вносили диоксид селена в концентрации 20 мг/л, оптимальной для развития культуры Y. lipolytica. Для йодирования в качестве источника йода использовали раствор йодида калия в концентрации г/л [Е.Б. Цугкиева, 2007]. Йодирование продукта осуществляли в аэробных условиях после начала стационарной фазы роста дрожжей (16-18 часов) в течение 1 часа при 37°С в присутствии окислителя - 1%-ной перекиси водорода.

При культивировании дрожжей в периодическом режиме в условиях гетерофазного глубинного культивирования на подготовленной зерновой дробине и после осуществления постферментационной обработки был получен белково-углеводный продукт, состоящий из биомассы дрожжей и твердой непрогидролизованной фазы дробины, который содержал 33,0% «сырого» протеина, «сырой» клетчатки - 9,5%, селена - 35,2 мг/кг и йода мг/кг. В продукте, обогащенном селеном, включение йода происходило на 7,0% эффективнее, чем в продукте, не содержащем селен. Микотоксины в полученных белковоуглеводных продуктах практически отсутствовали.

Гетерофазное культивирование молочнокислых культур на ферментолизатах Отбор продуцентов для гетерофазного глубинного культивирования на нативной дробине и ее ферментолизатах проводили среди штаммов молочнокислых бактерий Lactobacillus casei– B 7657, Lactobacillus acidophilus – AT-41, Lactococcus lactis ТБ2, ассоциативных культур кефирного грибка G и S, используемых на Ставропольском и Гагаринском молочных заводах, и неидентифицируемых культур молочнокислых бактерий, выделенных из данных кефирных грибков и растущих на глюкозе.

Эксперименты показали, что все исследованные молочнокислых культуры способны активно расти на средах, содержащих как молочную сыворотку и глюкозу, так и на ферментативных гидролизатах зерновой дробины. Для исследований были отобраны бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, которые обладали наибольшей активностью молочнокислого брожения по показателю снижения рН и общей титруемой кислотности (таблица 9).

Активность роста молочнокислых бактерий на ферментолизатах зерновой дробины Lactobacillus casei 6,70/4,70 120,0±1,25 6,70/4,80 118,0±1, Lactobacillus acidophilus 6,70/4,85 90,0±1,25 6,70/4,80 108,0±1, Ассоциативная культура кефирного грибка G Ассоциативная культура кефирного грибка S 6,70/4,60 130,0±1,28 6,70/4,60 128,0±1, Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка S Смешанные культуры, выделенные из кефирного грибка G Для глубинного гетерофазного культивирования молочнокислых культур на ферментолизатах зерновой дробины 10%-ную водную суспензию сырья обрабатывали мультиэнзимной композицией Ф-ПД-3 в концентрации 0,1% (масс.). Ферментативный гидролиз осуществляли в реакторе периодического действия при рН 5,0-5,5, t=500C и перемешивании 80-100 об/мин. Время экспозиции составляло 2 часа. При таких условиях подготовки субстрата концентрация РВ составила 35,0 г/л. В полученные ферментолизаты вносили минеральные соли в концентрациях, соответствующих их содержанию в среде «MRS» и трехсуточный инокулят бактерий L.casei и ассоциативной культуры кефирного грибка G в количестве 5,0% по объему при плотности популяции не менее 106 КОЕ/мл.

Молочнокислые микроорганизмы культивировали в периодическом режиме в анаэробных условиях при t=370С, рН 6,5-6,8 в течение 17-18 часов.

В процессе гетерофазного культивирования потребление молочнокислыми культурами редуцирующих сахаров составило 45-48%, плотность популяции L.casei – не менее 108 КОЕ/г, ассоциативной культуры кефирного грибка G – не менее 109 КОЕ/г. Титруемая кислотность продукта, содержащего бактерии L.casei, определялась на уровне 118-1200Т, продукта, содержащего ассоциативную культуру кефирного грибка G – 140-1450Т.

В результате проведенных опытов показано, что подобранные молочнокислые микроорганизмы - L. casei и ассоциативная культура кефирного грибка G - способны развиваться на ферментативных гидролизатах зерновой дробины, а продукт, получаемый при их культивировании на ферментолизатах, обладает всеми свойствами, определяющими его пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на обезжиренном молоке.

В пятой главе приведены способы получения биологически активных добавок, обладающих пробиотическими свойствами, на основе зерновой дробины и ее ферментолизатов.

Придание продукту пробиотических свойств возможно при культивировании на субстрате молочнокислых бактерий, которые для своего развития требуют сложных питательных сред и микроаэрофильных условий.

При разработке возможных способов получения пробиотических БАД была исследована возможность обогащения питательной среды продуктами автолиза продуцентов белка, предварительно культивируемых на ферментолизатах зерновой дробины, учитывали также такие техноэкономические показатели, как необходимость снижения энергоемкости, уменьшения количества технологических стадий и необходимости гарантий получения продукта требуемого качества, что возможно при замене аэробных процессов культивирования на анаэробные.

Исходя из этих положений, исследовали ряд способов получения белковоуглеводной добавки, обладающей пробиотическими свойствами:

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии гриб Trichoderma viride выращивали на измельченной стерильной дробине в условиях твердофазного культивирования. На второй стадии осуществляли автолиз грибной биомассы с добавлением этанола и на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 10.

Характеристика белково-углеводных продуктов на основе зерновой дробины, полученных при последовательном твердофазном культивировании гриба Tr. viride и молочнокислых автолиза грибных клеток, % а.с.в. 25,6±0,49 27,2±0,25 29,3±0,28 25,6±0,44 27,2±0,27 29,3±0, В том числе растворимый белок, г/л 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0,19 4,5±0,21 8,5±0,25 10,8±0, Потребление РВ*:

Титруемая кислотность, 0Т Молочная кислота, г/л «Сырой» протеин в полученном продук- 29,2±0,49 31,3±0,51 33,9±0,27 30,6±0,31 32,8±0,45 33,5±0, те, % а.с.в.

«Сырая» клетчатка в полученном продук- 13,2±0,25 13,0±0,29 12,9±0,21 12,8±0,29 13,1±0,33 13,1±0, те, % а.с.в.

*Начальная концентрация РВ - 15,0 г/л Результаты, представленные в таблице 10 показывают, что присутствие этилового спирта в среде до 3% стимулировало развитие молочнокислых организмов, причем, показатель титруемой кислотности для обоих вариантов составил 1401900Т. При этом, в среде отмечено накопление молочной кислоты: при культивировании L. casei – 8,710,8 мг/л при потреблении 77,384,0% РВ, при культивировании ассоциативной культуры кефирного грибка G – 9,010,8 мг/л при потреблении 80,786,3% РВ, содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки составило 29,233,9% а.с.в и 12,813,0% а.с.в., соответственно.

При исследовании биологической ценности полученных продуктов на тест-культуре Tetrahymena pyriformis было показано отсутствие острой токсичности, также были получены данные, подтверждающие их пробиотические свойства и антагонистические свойства по отношению к Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный аэробно-анаэробный процесс. На первой стадии дрожжи Yarrowia lipolytica аэробно выращивали на ферментативных гидролизатах нативной и измельченной зерновой дробины в условиях глубинного гетерофазного культивирования до потребления примерно 50% редуцирующих веществ, содержащихся в ферментолизате. На второй стадии после автолиза дрожжевых клеток на полученной среде в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии. Результаты представлены в таблице 11.

Результаты аэробно-анаэробного способа получения белково-углеводного продукта, обладающего пробиотическими свойствами, и показатели его качества Гетерофазное глубинное культивирование дрожжей Y.lipolytica «Сырой» протеин после автолиза, % а.с.в.

Анаэробное культивирование молочнокислых микроорганизмов «Сырой протеин», % а.с.в.:

-в продукте, содержащем ассоциативную культуру кефирного грибка G 23,0±0,23 30,0±0, Данные, представленные в таблице11, показывают, что на ферментолизатах измельченной дробины дрожжи развивались более активно, потребляя до 51% редуцирующих веществ, что обеспечивало после автолиза дрожжевых клеток накопление «сырого»

протеина в среде до 26,0% а.с.в., при этом содержание «сырой» клетчатки в твердой фазе уменьшалась с 18,0 до 10,2% а.с.в. При культивировании молочнокислых культур на такой среде потребление РВ составило около 93% при накоплении молочной кислоты до 13,5 г/л. Содержание «сырого» протеина и «сырой» клетчатки в полученном продукте определялось, соответственно, на уровне 30,0 и 10,2% а.с.в.

Показано, что полученные продукты обладали основными свойствами, определяющими их пробиотическую активность, что и исходные молочнокислые культуры при культивировании их на молоке, а также проявляли антагонистические свойства по отношению к условно-патогенной культуре Staphylococcus aureus.

• Двухстадийный анаэробный процесс. На первой стадии в микроаэрофильных условиях проводили твердофазное культивирование бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной стерильной дробине. На второй стадии после автолиза бактериальных клеток на полученном сырье в анаэробных условиях культивировали молочнокислые бактерии.

Результаты представлены в таблице 12.

При исследовании влияния штамма бактерий Bacillus cereus БП-46 на развитие молочнокислых микроорганизмов было показано отсутствие антагонистических отношений между культурами.

Показатели процесса последовательного твердофазного культивирования на зерновой дробине Bacillus cereus БП-46 и молочнокислых культур Титруемая кислотность, 0Т 80,0±1,25 70,0±1,25 120,0±1,30 150,0±1, Сырой протеин*, % а.с.в.:

-после твердофазного -после молочнокислого брожения Сырая клетчатка**, % а.с.в.

*Исходное содержание сырого протеина в дробине 21,0%.

**Исходное содержание сырой клетчатки в дробине 18,0%.

Результаты, представленные в таблице 12, показывают, что молочнокислые бактерии активно развивались на зерновой дробине, обогащенной продуктами автолиза бактерий Bacillus cereus БП-46, при этом содержание «сырого» протеина в продукте увеличивалось на 13,8%, «сырая» клетчатка гидролизовалась на 10,5%, показатель титруемой кислотности повышался до 120-1500Т, рН снижался с 6,9 до 4,0-4,3, плотность популяции молочных микроорганизмов составляла не менее 108 КОЕ/г. Содержание молочной кислоты повышалось в среднем, в 1,5-2 раза.

Исследование свойств полученной кормовой белково-углеводной добавки показало, что все культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в полученных продуктах, обладали терморезистентностью в диапазоне 60-650С и устойчивостью к фенолу, поваренной соли; к действию пищеварительных ферментов и желчи.

Таким образом, на основании проведенных исследований показана возможность получения биологически активных кормовых добавок с различными функциональными свойствами на основе зерновой дробины (белково-углеводная биологически активная добавка, белково-углеводная биологически активная добавка, обогащенная микроэлементами селеном и йодом и белково-углеводная биологически активная добавка, обладающая пробиотическими свойствами), при этом данные продукты могут быть получены на ферментативных гидролизатах зерновой дробины при культивировании дрожжей в аэробных условиях для обогащения белком, при твердофазном культивировании гриба рода Trichoderma или бактерий рода Bacillus с последующим автолизом микробных клеток и культивированием молочнокислых микроорганизмов для придания продукту пробиотических свойств.

Общая схема переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами представлена на рисунке 3.

Способы повышения биологической ценности зерновой дробины для получения БАД с Твердофазное культивирование Гетерофазное культивирование Культивирование молочнокислых бактерий и ассоциативных Рис. 3. Схема возможных способов переработки зерновой дробины в БАД с функциональными свойствами

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Исследован ферментативный гидролиз отходов пивоваренного производства – зерновой дробины – под действием целлюлолитического комплекса ферментов грибов Trichoderma viride, бактерий Bacillus cereus БП-46 и технических мультиэнзимных композиций, включающих целлюлолитические и протеолитические ферменты;

- определены условия культивирования гриба Tr. viride на зерновой дробине в глубинной культуре, при накоплении целлюлолитических ферментов в среде до 25 ед./мл и снижении содержания «сырой» клетчатки в дробине с 19,0 до 15,0% а.с.в.; показана возможность использования посевного материала гриба в виде спор и вегетативных клеток;

- показана биодеструкция зерновой дробины как при твердофазном культивировании гриба Trichoderma viride, так и при использовании его культуральной жидкости, обеспечивающая снижение в дробине «сырой» клетчатки на 6%. и накопление в среде РВ до 16, г/л;

- методом мультисубстратного тестирования проведена таксономическая идентификация штамма бактерий Bacillus БП-46, показана его принадлежность к виду B.cereus. При твердофазном культивировании бактерий Bacillus cereus БП-46 на измельченной дробине «сырая» клетчатка в субстрате снижалась на 11,5%.

- на основании сравнительной оценки эффективности воздействия на зерновую дробину трех мультиэнзимных композиций Ф-ПД-1, Ф-ПД-2 и Ф-ПД-3, отличающихся составом и соотношением уровней активности в мультисистемах, был отобран препарат Ф-ПДопределены условия его применения, обеспечивающие при 2-х часовой экспозиции накопление РВ в ферментолизате до 35,0 г/л, снижение «сырой» клетчатки и «сырого» протеина в твердой фазе с 19,0 до 8,5% и с 25,0 до 15,0%, соответственно.

2. При исследовании влияния химических аналогов факторов микробного анабиоза – алкилоксибензолов (С7- и С12-АОБ) на стабильность ферментативной активности мультиэнзимной композиции Ф-ПД-3 показано, что гомолог С7-АОБ в концентрации 1,0 мг/см стабилизировал активность ферментов, входящих в состав Ф-ПД-3, при этом уровень продуктов гидролиза – редуцирующих сахаров – повышался до 40,0 г/л. Препарат С12АОБ практически не оказывал положительного влияния на ферментативную активность Ф-ПД-3.

3. Исследована активность роста семи молочнокислых бактерий на глюкозе и ферментолизатах зерновой дробины. Отобраны культуры, наиболее активно развивающиеся на ферментолизатах зерновой дробины - бактерии Lactobacillus casei и ассоциативная культура кефирного грибка G, при этом ассоциативная культура кефирного грибка G обладала большей активностью молочнокислого брожения.

4. Разработаны способы получения БАД с функциональными свойствами:

- белково-углеводной добавки, содержащей до 32,0% «сырого» протеина, а также белковоуглеводной добавки, обогащенной микроэлементами: селеном (35,2 мг/кг) и йодом (32, мг/кг) при гетерофазном культивировании дрожжей Yarrowia lipolytica на ферментолизатах дробины;

- белково-углеводных добавок с содержанием «сырого» протеина не менее 30,0%, «сырой» клетчатки не более 10,0%, обладающих пробиотическими свойствами, на основе двухстадийного культивирования дрожжей Y. lipolytica, или грибов Tr. viride, или бактерий B. cereus, автолиза их клеток и последующего выращивания молочнокислых бактерий;

- белково-углеводной кормовой добавки при двухстадийном твердофазном процессе культивирования Bacillus cereus БП-46 на измельченной зерновой дробине в анаэробных условиях, автолизе клеток бактерий и последующем выращивании молочнокислых микроорганизмов. Получен продукт с содержанием «сырой» клетчатки не более 8,0% и «сырого»

протеина не менее 34,0% при плотности популяции молочнокислых культур не менее КОЕ/г.

6. По стандартным методикам определена пробиотическая активность полученных БАД на основе зерновой дробины, показано, что культуры молочнокислых микроорганизмов, содержащиеся в продуктах были терморезистентны при t=60-650C, устойчивы к действию поваренной соли, желчи и пищеварительных ферментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Касаткина, А.Н. Использование мультиэнзимных композиций для деструкции пивной дробины / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Э.В. Удалова // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 59-65.

2. Касаткина, А.Н. Способы повышения биологической ценности дробины / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова // Комбикорма – 2008. – № 5 – С. 51-52.

3. Касаткина, А.Н. Разработка биотехнологических способов биодеградации дробины как основы для получения белково-углеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова // Сб. мат. Всероссийской научно-технической конференции «Наука-производствотехнологии-экология». – Киров: Изд-во ВятГУ, 2006. – С. 179-180.

4. Касаткина, А.Н. Исследование пивной дробины как сырья для получения белковоуглеводной кормовой добавки / А.Н. Касаткина // Материалы IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, 5-7 декабря 2006 г. – Пущино: Изд-во ООО «МАКС Пресс», 2006. – С. 118-119.

5. Касаткина, А.Н. Дробина как сырье для получения белково-углеводных кормовых добавок и препаратов с пробиотическими свойствами / А.Н. Касаткина, Г.А. Егерева // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», 15-16 ноября 2007 г. – М: МГУПБ, 2007. – С.17-18.

6. Касаткина, А.Н. Практическое использование специфических микроорганизмов для трансформации целлюлозосодержащего сырья / А.Н. Касаткина, Н.Б. Градова, Н.А. Ушакова // Тез. докл. международной школы–конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвящённой 40-летию института ГосНИИгенетика, 21-24 октября г. - Москва – Пущино, 2008 г. – С. 43.

7. Заявка на патент на изобретение № 2008119515. Способ получения белково-углеводной биологически активной кормовой добавки / А.Н. Касаткина, Е.К. Лещина, Н.Б. Градова. – заявл. 19.05.2008.



Похожие работы:

«ДОЛГУШИН Александр Борисович СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПРОГРАММНО-ЦЕЛЕВОГО УПРАВЛЕНИЯ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЕМ (НА ПРИМЕРЕ ПРИОРИТЕТНОГО НАЦИОНАЛЬНОГО ПРОЕКТА) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (экономика природопользования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва 2012 2 Работа выполнена на кафедре управления природопользованием и охраны окружающей среды Федерального государственного бюджетного...»

«ГРИГОРИЧЕВ КОНСТАНТИН ВАДИМОВИЧ ПРИГОРОДНЫЕ СООБЩЕСТВА КАК СОЦИАЛЬНЫЙ ФЕНОМЕН: ФОРМИРОВАНИЕ СОЦИАЛЬНОГО ПРОСТРАНСТВА ПРИГОРОДА 22.00.04 – социальная структура, социальные институты и процессы Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора социологических наук Хабаровск – 2014 Диссертация выполнена в ФГБОУ ВПО Иркутский государственный университет Научный консультант : доктор исторических наук, профессор Дятлов Виктор Иннокентьевич Официальные оппоненты : Рязанцев...»

«Зачиняев Ярослав Васильевич Экологические проблемы современного животноводства (на примере коневодства) 03.02.08 – Экология 06.02.10 – Частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Петрозаводск - 2012 1 Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете сервиса и экономики Научный консультант : доктор сельскохозяйственных наук, Сергиенко Сергей Семёнович...»

«ЗАЙЦЕВ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА НА САМОФЕРТИЛЬНОСТЬ И ПЧЕЛОПОСЕЩАЕМОСТЬ Специальность 06.01.05 – селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар – 2014 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт масличных культур имени В.С. Пустовойта Россельхозакадемии в 2006-2008...»

«Бахвалов Павел Алексеевич Развитие схем на основе квазиодномерного подхода для решения задач аэроакустики на неструктурированных сетках Специальность 05.13.18 математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре математического моделирования Московского физико-технического института (государственного университета) Научный руководитель...»

«ТКАЧУК АРТЕМ ПЕТРОВИЧ РАЗРАБОТКА МЕТОДА СТАБИЛИЗАЦИИ ТРАНСГЕНОВ ПОСЛЕ ИХ ИНТЕГРАЦИИ В ГЕНОМ Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010   Работа выполнена в группе биологии теломер Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Савицкий Михаил Юрьевич...»

«ДМИТРИЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА МЕТОДИКА РАЗВИТИЯ ПРОФЕССИОНАЛЬНОПЕДАГОГИЧЕСКОЙ КОМПЕТЕНТНОСТИ В ОБЛАСТИ ПРОЕКТИРОВАНИЯ УЧЕБНЫХ МАТЕРИАЛОВ ПО ИНФОРМАТИКЕ У УЧИТЕЛЯ НАЧАЛЬНЫХ КЛАССОВ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (информатика) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск – 2009 Работа выполнена на кафедре информатики и методики преподавания информатики Государственного образовательного учреждения высшего...»

«Северов Дмитрий Станиславович КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОТОКОВ ДАННЫХ В ПАКЕТНЫХ СЕТЯХ НА ОСНОВЕ УРАВНЕНИЙ В ЧАСТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Специальность 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена на кафедре вычислительной математики Московского физико-технического института (государственного университета) Научный руководитель :...»

«Полякова Татьяна Викторовна МАРКЕТИНГ ТЕРРИТОРИЙ КАК ФАКТОР СОЦИАЛЬНО-ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ И ФОРМИРОВАНИЯ БЛАГОПРИЯТНОГО ИМИДЖА ТЕРРИТОРИИ 08.00.05 Экономика и управление народным хозяйством: 9 - маркетинг АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Волгоград – 2011 Работа выполнена в Волгоградском государственном техническом университете Научный руководитель доктор экономических наук, профессор Иванюк Ирина Александровна. Официальные...»

«ФРОЛОВ Даниил Анатольевич ФЛОРА БАССЕЙНА РЕКИ СВИЯГИ 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей Викторович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мартыненко Вера Антоновна...»

«ГРИГОРЬЕВ Вениамин Юрьевич КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МОДЕЛИ СТРУКТУРА–СВОЙСТВО ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ 02.00.03 – органическая химия 02.00.04 – физическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Черноголовка – 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ РАН Официальные Балакин Константин Валерьевич, доктор оппоненты: химических наук, Федеральное государственное...»

«Федосеева Елена Васильевна СОПОСТАВЛЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ УСЛОВИЙ СРЕДЫ НА ВЫЖИВАЕМОСТЬ И ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ БАЙКАЛЬСКИХ АМФИПОД И ГОЛАРКТИЧЕСКОГО GAMMARUS LACUSTRIS 03.00.18 - Гидробиология 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2010 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии Иркутского государственного университета и в лаборатории экотоксикологического анализа...»

«ЯНОВ Владимир Иванович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ УРОЖАЯ РАЗНЫХ ВИДОВ ПОЛЫНИ И НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ПОЛЫНИ ЭСТРАГОННОЙ НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ СОЛОНЦЕВАТЫХ ПОЧВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ПРИКАСПИЯ 06.01.01 – Общее земледелие АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Ставрополь – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Калмыцкий государственный университет в 1991–2008 гг. Научный консультант : доктор сельскохозяйственных наук...»

«ЧЕПУРНАЯ Анна Александровна ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ АНАЛИЗ ДИНАМИКИ РАСТИТЕЛЬНОСТИ В ПРЕДЕЛАХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ВОСТОЧНОЕВРОПЕЙСКОЙ РАВНИНЫ В МИКУЛИНСКОЕ МЕЖЛЕДНИКОВЬЕ (ПО ПАЛИНОЛОГИЧЕСКИМ ДАННЫМ) 25.00.25 – Геоморфология и эволюционная география Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва, 2009 Работа выполнена в лаборатории Эволюционной географии Института географии РАН Научный руководитель : Доктор географических наук, профессор...»

«ЧИРКОВА Вера Михайловна РАЗВИТИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ УМЕНИЙ У СТУДЕНТОВ-МЕДИКОВ В ПРОЦЕССЕ ИЗУЧЕНИЯ РУССКОГО ЯЗЫКА КАК ИНОСТРАННОГО ПРИ ПОДГОТОВКЕ К КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ 13.00.08 – теория и методика профессионального образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата педагогических наук Курск 2011 Работа выполнена на кафедре методики преподавания иностранных языков Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«Горюнова Ольга Борисовна РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С ЛИЧИНКАМИ КОМАРОВ 03.00.23 – биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Российского ХимикоТехнологического Университета имени Д.И. Менделеева Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент Марквичев Николай Семенович Официальные оппоненты : доктор технических наук, профессор Бирюков...»

«РЕЗНИКОВА ИРИНА БОРИСОВНА ФОРМИРОВАНИЕ И РЕАЛИЗАЦИЯ РЕПРОДУКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ГЛАВНОГО КОЛОСА СОРТОВ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ АГРОПРИЕМОВ Специальность: 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Краснодар 2009 1 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Цаценко Людмила Владимировна Официальные...»

«ПАЩЕНКОВ МИХАИЛ ВЛАДИМИРОВИЧ ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ НА ОСНОВЕ МУРАМИЛПЕПТИДОВ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДНК: ОТ ЭКСПЕРИМЕНТА К КЛИНИКЕ 03.03.03 – Иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва, 2013 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства Научный консультант : Доктор медицинских наук, профессор Пинегин Борис...»

«БОРОВИЧЕВ Евгений Александрович ПЕЧЕНОЧНИКИ ЛАПЛАНДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО БИОСФЕРНОГО ЗАПОВЕДНИКА (МУРМАНСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории флоры и растительных ресурсов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Полярноальпийский ботанический сад-институт им. Н. А. Аврорина Кольского научного центра РАН (ПАБСИ КНЦ РАН) Научный...»

«БУЛИН-СОКОЛОВА Елена Игоревна НАУЧНО-ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ИНФОРМАТИЗАЦИИ ОБЩЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.02 - Теория и методика обучения и воспитания (информатизация образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Москва 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии образования Институт содержания и методов обучения Научный консультант : академик РАО, доктор педагогических наук, профессор Кузнецов Александр...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.