WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

КОВАЛЕВА Гульмира Кажгалиевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ

КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ FOMITOPSIS OFFICINALIS

(VILL.: FR.) BOND. ET SING., GANODERMA APPLANATUM (PERS.) PAT.

И TRAMETES VERSICOLOR (L.:FR.) PILAT

Специальность 03.00.24 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Громовых Татьяна Ильинична

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гарибова Лидия Васильевна кандидат биологических наук Горшина Елена Сергеевна

Ведущая организация: Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск

Защита состоится « 10 » апреля 2009 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Московском государственном университете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1; тел./факс (495) 939-39-70.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из приоритетных направлений развития современных микологии и биотехнологии является разработка технологий с использованием базидиальных грибов для получения биологически активных соединений. Благодаря исследованиям последних десятилетий, стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. Многие из этих соединений являются фармакологически активными и, по сравнению с продуктами химического синтеза, менее токсичны и более эффективны при применении в медицинской практике. Большинство работ по поиску и выделению биологически активных веществ базидиомицетов проведены с использованием плодовых тел (Беккер, 1988; Белова, 2004; Гарибова, 2003; 2005; 2008; Феофилова, 2002; Шиврина и др., 1969; Reshetnicov et.al., 2001; Sliva, 2006). Известно, что биологически активные вещества высших грибов содержатся не только в базидиомах, но и в вегетативном мицелии гриба, получаемом путем жидкофазного и твердофазного культивирования (Автономова и др., 2006, Краснопольская и др., 2007; Сидоренко, 2007). Важным преимуществом получения биомассы мицелия с помощью биотехнологических методов являются экологическая чистота получаемых препаратов, возможность создания производства и доступность сырьевых ресурсов.

Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный базидиомицетам, чрезвычайно велик, мало работ по исследованию биологической активности плодовых тел в сравнении с биологической активностью вегетативного мицелия. Кроме того, немногочисленны сведения о химическом составе и бактерицидных свойствах плодовых тел и мицелия многих дереворазрушающих грибов, в том числе представителей из родов Fomitopsis, Ganoderma и Trametes.

Поиск и выделение новых штаммов, выделенных в Сибири и других восточных регионах, открывает перспективы пополнения коллекций и дает возможность их использования в биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель работы – изучение биологических особенностей и биохимического состава мицелия и плодовых тел ксилотрофных базидиомицетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor и разработка условий культивирования мицелия. В связи с целью были поставлены следующие задачи:

- создание коллекции культур ксилотрофных базидиомицетов и проведение скрининга штаммов;

- определение диапазона изменчивости штаммов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor по морфолого-культуральным признакам и показателям роста при различных условиях культивирования;

- проведение сравнительной оценки биохимического состава вегетативного мицелия и плодовых тел базидиомицетов;

- изучение динамики накопления биомассы мицелия при поверхностном жидкофазном культивировании;

- изучение токсичности и зоопатогенности в отношении теплокровных животных;

- изучение антимикробной активности метаболитов и экстрактов из мицелия и плодовых тел в отношении условно-патогенных микроорганизмов;

- изучение противоопухолевой активности экстрактов мицелия и плодовых тел изучаемых штаммов;

- изучение возможности использования растительных отходов сельскохозяйственного и лесоперерабатывающего производства для выращивания мицелия штаммов.

Научная новизна.

1) Впервые проведен сравнительный анализ биохимического состава мицелия штаммов, выделенных из плодовых тел базидиомицетов Средней Сибири и Республика Тыва. Показано, что мицелий базидиомицетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor может быть использован для получения биологически активных соединений. В мицелии Fomitopsis officinalis идентифицировано биологически активное соединение агарициновая кислота.

2) Проведена оценка продуктивности штаммов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor и показана возможность твердофазного культивирования изучаемых штаммов базидиомицетов на отходах лесоперерабатывающих и гидролизных производств.

3) Изучена антимикробная и противоопухолевая активность экстрактов плодовых тел и мицелия отобранных штаммов базидиомицетов в отношении клеток асцитной карциномы Эрлиха.

Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов базидиальных грибов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor, которая может быть использована в работе по скринингу продуцентов для биотехнологических производств, перспективные штаммы Fomitopsis officinalis штамм Tyv-2006 и Ganoderma applanatum штамм G.a.-04 депонированы в ВКПМ. Разработаны оптимальные условия и среды для жидкофазного и твердофазного культивирования мицелия базидиомицетов. Полученные данные можно использовать для разработки лабораторных регламентов культивирования мицелия перспективных штаммов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на Международной школе-конференции «Генетика и селекция микроорганизмов (МоскваПущино, 2006); II Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007); IV съезде биотехнологов России (Пущино, 2006); Всероссийской конференции аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2006г.); Всероссийской научно-практической конференции «Лесной и химический комплекс. Проблемы и решения» (Красноярск, 2006, 2008); городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска», (Красноярск, 2007 г.); семинаре кафедры микологии и альгологии МГУ (Москва, 2008); семинаре кафедры химия пищи и биотехнологии Московского государственного университета прикладной биотехнологии (Москва, 2008); семинаре проблемной лаборатории Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2008); Всероссийской конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск, 2009. Диссертация апробирована на заседании кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ 3 сентября 2008 г.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает работ, в т.ч. 89 на иностранных языках. Общий объем диссертации 171 страница (основной текст – 160 страниц, приложение 11 страниц). Диссертация включает 28 рисунков и 26 таблиц.

Публикации. Материалы диссертации изложены в 11 публикациях (из них статьи в журналах, рекомендованных ВАК). Экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично соискателем и опубликованы в соавторстве с руководителями и сотрудниками, работавшими совместно с автором в процессе выполнения исследований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследований, показана научная новизна и практическая ценность результатов работы.

В первой главе представлен анализ и обобщение литературы по экологическим группам и географическому распространению ксилотрофных базидиомицетов Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor, а также даны современные сведения об их систематическом положении в царстве Fungi. Проведен литературный анализ по условиям культивирования базидиомицетов, описаны преимущества и недостатки твердофазного и жидкофазного культивирования с целью массового получения биологически активного вегетативного мицелия. Представлен обзор публикаций, посвященный мировому опыту практического использования афиллофоровых базидиомицетов, как продуцентов биологически активных веществ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При выполнении работы объектами исследования служили базидиомицетовые грибы: трутовик лекарственный (лиственничная губка) – Fomitopsis officinalis (Vill.:

Fr.) Bond. et Sing., плоский трутовик – Ganoderma applanatum (Pers.) Pat. и трутовик разноцветный – Trametes versicolor (L.:Fr.) Pilat. Для выделения изолятов Fomitopsis officinalis и Trametes versicolor проводили сбор плодовых тел из пораженной древесины в лиственничных лесах Республики Тыва. Изоляты G. applanatum выделяли из плодовых тел, собранных в различных лесорастительных зонах Красноярского края.

Выделение грибных штаммов в культуру проводили двумя методами: споровым и тканевым. Споры суспендировали в стерильной воде и высевали в чашки Петри на сусловый агар с добавлением молочной кислоты (4%), сусловый агар с добавлением и 3% лиственничных опилок и картофельно-декстрозный агар. После 1-3 суток культивирования наблюдали с помощью микроскопа при увеличении в 100 раз проросшие споры и формирование микроколоний. Через 5-7 суток отдельные грибные колонии образовавшиеся, как правило, из нескольких проросших спор, отсевали в пробирки со скошенным сусловым агаром.

Тканевым методом выделение культур проводили из фрагмента гименофора плодового тела или тяжа мицелия из поражённой древесины, которые помещали в центр чашки Петри на поверхность агаризованной среды – сусловый агар с добавлением молочной кислоты (4%), сусловый агар с добавлением 1 и 3% лиственничных опилок и картофельно-декстрозный агар; через 3-7 суток роста мицелий отсевали в пробирки.

Очистку грибных культур от сопутствующей бактериальной микрофлоры проводили путем посева мицелиальной культуры на агаризованные питательные среды с добавлением 4% молочной кислоты. После чего проводили микрокопирование для оценки возможного роста бактерий.

Культурально-морфологические признаки исследуемых штаммов изучали на различных агаризованных питательных средах (сусловый агар, сусловый агар с добавлением 1 и 3 % лиственничных опилок, картофельно-декстрозный агар и грибной агар). Учет результатов проводили в течение всего срока наблюдения по следующим показателям: диаметр разрастания колоний, текстура и форма колоний, пигментация мицелия, плотность и высота воздушного мицелия, суточная линейная скорость роста, ростовой коэффициент. Отбор продуктивных штаммов проводили по показателям ростового коэффициента на исследуемых питательных средах.

Изучение микроморфологических признаков штаммов проводили в камерах Ван-Тигема с использованием световой микроскопии при помощи светового микроскопа марки LW Scientific (США). Определяли наличие долипоровой септы в клеточной перегородке. Микроморфологию ядер изучали с использованием люминисцентной микроскопии, для чего 7, 14 и 21-суточный мицелий фиксировали на покровном стекле в модифицированном растворе Карнуа с последующим окрашиванием реактивом ДАПИ (4',6-диамидино-2-фенилиндол, SIGMA) в концентрации 500 нг/мл (Ota et al., 1998); в работе использовали микроскоп Axioskop 40 FL, фильтр 02 (Zeiss).

Для изучения микроморфологии бластоконидий использовали сканирующую электронную микроскопию. Агаровые блоки с наросшим 7, 14 и 21-суточным мицелием фиксировали в парах осмия. После высушивания образцы закрепляли, напыляли смесь платины и палладия (IB-3 Ion Coater) и просматривали с помощью сканирующего электронного микроскопа «Hitachi» S-405A лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова, за что автор выражает благодарность доктору биологических наук кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова О.В. Камзолкиной.

Видовую принадлежность определяли на основании морфологических признаков плодовых тел, описывавшихся при сборе грибов, спор и морфологокультуральных признаков (тип колоний, характер роста, цвет мицелия, запах, наличие экзопигмента). Результаты всех исследований были сопоставлены с данными определителей (Stalpers, 1978; Бондарцева, 1998).

Рост мицелия штаммов изучали при различных значениях температуры (20,0, 25.0, 30.0, 35.0 и 40 °С) и рН (от 3.5 до 7.5) и определяли оптимальные параметры для каждого штамма. Изучение динамики накопления биомассы штаммами базидиомицетов проводили путем поверхностного жидкофазного культивирования на пивном неохмеленном сусле (4°Б) при температуре 25±1 °С. Накопление биомассы оценивали весовым методом на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 и 40-е сутки культивирования. Для гриба F. оfficinalis использовали модифицированную питательную среду пивное сусло с дополнительным внесением 1% лиственничных опилок.

Изучение биохимического состава мицелия и плодовых тел базидиомицетов проводили по классическим методам. Экстрактивные вещества, получали путем холодной, горячей и исчерпывающей экстракции дистиллированной водой мицелия (возраста 15, 20 и 30 суток) и плодовых тел (Ушанова и др., 2004). Общее количество белка определяли по Г.А. Бузуну (Бузун и др., 1982); качественный состав аминокислот – с помощью автоматического аминокислотного анализатора типа ААА 339М (Microtechna, Чехия); количество легко- и трудногидролизуемых углеводов – по методу Кизеля и Семигановского (Рязанова и др., 1996; Ушанова и др., 2004). Содержание липидов с их последующим разделением на нейтральные, глико - и фосфолипиды – по методу Блайя и Дайера (Кейтс, 1975). Агарициновую кислоту в мицелии определяли методом УФ-спектроскопии, разработанным М.В. Гаврилиным с соавторами (2006). Экстракцию агарициновой кислоты из мицелия проводили в смеси хлороформ-этанол 1:2. Идентификацию агарициновой кислоты проводили на хроматограмме с использованием хроматографических пластинок "Сорбфил ПТСХ-А-УФ ". В качестве контроля использовали стандартный образец SIGMA ALDRICH. Количество золы определяли путем сжигания пробы в муфельной печи (Плешков, 1976; Рязанова, 1996); состав минеральных компонентов золы исследовали спектральным методом на спектрометре рентгеновском сканирующем кристалл-дифракционном «Спектроскан»

(производство Чехия). Определение массовой доли витаминов в мицелии исследуемых базидиомицетов проводили хроматографическим методом на анализаторе жидкости «Флюорат-02» (Битуева и др., 2006).

Изучение химического состава культуральной жидкости, содержащей продукты метаболизма гриба F. officinalis, проводили методом хромато-масс-спектрометрии на газожидкостном хроматографе «Aglent Technologies» модель 6890N фирмы «Хьюлетт-Паккарт» (США) с масс-селективным детектором «Aglent Technologies» модель 5973.

Твердофазное культивирование проводили на различных растительных субстратах: коре и древесной зелени пихты, лиственничных опилках, гидролизном лигнине и зерне пшеницы. Оценку роста изучаемых штаммов проводили по показателям среднесуточная скорость роста и характер формирования воздушного мицелия.

Изучение зоопатогенности экстрактов мицелия и плодовых тел изучаемых штаммов базидиомицетов проводили на кроликах по общепринятым методикам. Изучение токсичности водных экстрактов и метаболитов проводили на белых нелинейных мышах обоего пола (Краснюк, 2006; Яковлев, 2002).

Антимикробную активность культуральных жидкостей штаммов, содержащих продукты метаболизма, и водных экстрактов из мицелия и плодовых тел базидиомицетов изучали методом лунок (Егоров, 1994; 1995; Бурмистрова, 2002). В качестве тест-культур использовали штаммы грамположительных и грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов Staphylococcus aureus, S. cohnii, S. epidermidis, S. warneri, S. haemolyticus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli kSalmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и Citrobacter freundii, а также дрожжеподобного гриба Candida albicans.

Оценку противоопухолевой активности водных экстрактов из мицелия и плодовых тел исследуемых базидиомицетов проводили in vitro и in vivo на асцитной карциноме Эрлиха (АКЭ). Цитопатический эффект водных экстрактов in vitro оценивали через 20, 60, 120 и 180 минут инкубирования опухолевых клеток в среде 199 по их физиологическому состоянию с окрашиванием 1 % раствором метиленовой сини.

Изучение противоопухолевой активности экстрактов in vivo проводили на белых мышах аутбредной популяции ICR одного пола в возрасте 3 месяцев. Противоопухолевый эффект in vivo оценивали по продолжительности жизни животных, объему опухоли и количеству опухолевых клеток в организме животных.

Все результаты исследований обрабатывали статистически, используя пакет программ Statistica 6.0.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ АФИЛЛОФОРОИДНЫХ

ГРИБОВ FOMITOPSIS OFFICINALIS, GANODERMA APPLANATUM И

TRAMETES VERSICOLOR

Морфологические и культуральные характеристики штаммов В период с 2002 по 2006 гг. исследования были направлены на получение изолятов из плодовых тел (2-х и 3-х летнего возраста) Fomitopsis officinalis, Trametes versicolor и Ganoderma applanatum. Общее количество выделенных и отобранных для анализа штаммов F. officinalis составило – 15 (пять из которых выделено из тяжей мицелия поврежденной древесины лиственницы), G. applanatum – 10 и Trametes versicolor – 11 (в том числе использовали штамм В 18/91Trametes versicolor, выделенный из плодового тела в 1999 г. и любезно предоставленный к.б.н., доц. Н.В. Пашеновой).

Изучение культурально-морфологических признаков штаммов, получение плодовых тел в искусственных условиях, наличие долипоровой септы в клеточной перегородке, а также сопоставление результатов сканирующей электронной микроскопии выделенных мицелиальных культур с коллекционными штаммами доказывает, что выделенные из плодовых тел мицеллиальные культуры являются представителями видов F. officinalis, Trametes versicolor и G. applanatum, соответственно (Бондарцев, 1953; Бондарцева, 1998; Сафонов, 2000; Ainsworth and Bisby’s dictionary of the fungi, 2001).

Культивирование грибов F. officinalis, Trametes versicolor и G. applanatum показало, что штаммы способны расти на сусло-агаре, но с разной скоростью и характером формирования воздушного мицелия и специализированных структур.

Анализ культурально-морфологических признаков изолятов Fomitopsis officinalis показал наличие групп штаммов, имеющих различные показатели. Так штаммы, выделенные из тяжей мицелия, имели более низкий ростовой коэффициент (от 15,45 до 18,30) и среднесуточную скорость роста (от 0,75 до 0,85) на питательной среде сусло-агар. Способность к образованию бластоконидий была невысокой и составляла на 30-е сутки культивирования 6,0±0,40х107 штук на см2. Из 10 штаммов, выделенных из плодовых тел 2-х и 3-х летнего возраста, 3 имели ростовой коэффициент от 24,45 до 25,60 (различия недостоверны), и среднесуточную скорость роста от 0,90 до 0,96; титр бластоконидий был высоким на 30-е сутки и составлял 5,60±0,80х109 штук на см2. Семь штаммов имели ростовой коэффициент от 20,60 до 22,55 (различия недостоверны), а среднесуточная скорость роста составляла 0,65.

Титр бластоконидий на 30-е сутки культивирования составлял 7,50±0,80х108 штук на см2.

Штаммы F. officinalis формируют обильный, густой, септированный, полиморфный воздушный мицелий белого цвета с многочисленными пряжками одиночного, реже медальонообразного типа, размер гиф от 0.5-1.2 до3.5-5.8 мкм. Хламидоспоры и склероции не образуют. На основе показателей скорости роста, расчета ростового коэффициента и способности к образованию плодовых тел и бластоконидий отобран штамм Tyv-2006 F. officinalis (ВКПМ-968) (рисунок 1 ).

Рисунок 1 – Морфология мицелия штамма Tyv-2006 Fomitopsis officinalis.

Стрелками указаны: А – пряжки одиночного типа, Б и В – бластоконидии на конидиеносцах; Г – дикариотический мицелий Изучение культуральных признаков G. applanatum показало, что изоляты, выделенные как из плодовых тел как 2-х летнего, так и 3-х летнего возраста, делятся также на две группы: имеющие ростовой коэффициент 28,60 и среднесуточную скорость роста от 0,95 и 31,50 и среднесуточную скорость роста 1,18 (различия этих показателей достоверны). Штаммы G. applanatum образуют разветвленный, септированный толстостенный мицелий, с многочисленными пряжками одиночного типа. Генеративные гифы бесцветные, изредка буроватые. На 20-е сутки культивирования на сусло-агаре формируют коралловидный плотный мицелий (рисунок 2). По способности к формированию плодовых тел штаммы различались: штаммы, имеющие ростовой коэффициент 31,50, формировали плодовые тела на 35-е сутки культивирования, а штаммы с ростовым коэффициентом 28,60 – на 45-е сутки. Для дальнейших исследований был отобран штамм G.a.-04 G. applanatum (ВКПМ-983).

Рисунок 2 – Морфология мицелия штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum.

Стрелками указаны: А – пряжки, Б – коралловидный мицелий; В – дикариотический мицелий; Г – тонкий мицелий Наиболее высокими показателями ростового коэффициента отличались штаммы T. versicolor. Штаммы, выделенные из плодовых тел 2-х и 3-х летнего возраста также были выделены в две группы: имеющие ростовой коэффициент на сусло-агаре от 85,60 до 94,50 и среднесуточную скорость роста 3, 25 – 3,85, штаммы, имеющие более низкие показатели ростового коэффициента (78,80-82,50) и среднесуточную скорость роста 2,80 – 3,5). Но наибольший ростовой коэффициент (103,40) на сусло-агаре отмечен у штамма В18/91 T. versicolor, выделенного в 1999 г. Среднесуточная скорость роста этого штамма составляла 4,93, а ростовой коэффициент 103, что, вероятно, связано с многолетним поддержанием штамма в лабораторных условиях в активном состоянии. Все штаммы T. versicolor хорошо культивируется на агаризованных питательных средах с образованием густого разветвленного, септированного мицелия, с многочисленными пряжками одиночного типа. Вегетативное спороношение не выявлено. Для дальнейших исследований был использован штамм В18/91 T. versicolor (рисунок 3).

Рисунок 3 - Морфология мицелия штамма В 18/91 Trametes versicolor. Стрелками указаны: А – мицелий разной толщины с пряжками; Б – пряжка и утолщение клетки мицелия; В – вздутия в районе септ; Г – скелетный мицелий с толстыми клеточными стенками; Д – дикарион; Е – дикариотический мицелий Оценка динамики роста мицелия изучаемых штаммов на агаризованных питательных средах показала, что максимальная колонизация субстратов достигается в различный период. Наилучшими агаризованными питательными средами, по показателям среднесуточной скорости роста и ростовому коэффициенту для культивирования Fomitopsis officinalis и Ganoderma applanatum являются сусловый агар и сусловый агар с добавлением 1% лиственничных опилок (таблица 1).

Таким образом, на основании показателей ростового коэффициента и среднесуточной скорости роста на всех питательных средах к быстро растущим был отнесен В 18/91 T. versicolor, тогда как штаммы Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum – к медленно растущим. Для накопления биомассы для штаммов Tyv- F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum следует использовать сусло с добавлением 1% лиственничных опилок, а для штамма 18/91 T. versicolor питательную среду, содержащую крахмал и декстрозу.

Таблица 1 – Ростовые показатели изучаемых штаммов базидиомицетов на агаризованных питательных средах Питательная среда Примечание: в числителе – показатель среднесуточной скорости роста штамма, в знаменателе – ростовой коэффициент Исследования влияния температуры на скорость роста штаммов показали, что для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis наиболее оптимальной является температура 25- С, тогда как для роста мицелия штаммов G. applanatum и T. versicolor – 15-25 оС.

Гриб F. оfficinalis начал осваивать субстрат на сусловом агаре лишь при +25 оС, тогда как при росте на сусловом агаре с добавлением 1% лиственничных опилок – при С. Незначительный рост при самой низкой исследуемой температуре (+5 оС), был зафиксирован у гриба T. versicolor.

Следует отметить, что при понижении температуры культивирования до +15 оС изменялась морфология колонии штаммов G. applanatum и T. versicolor: воздушный мицелий становился рыхлым, паутинистым. Вместе с тем, более высокий (низкий) уровень среднесуточной скорости роста и ростового коэффициента изучаемых штаммов по отношению друг другу, имеет тенденцию сохраняться при всех температурах культивирования. Наиболее четко это прослеживается для штамма В 18/91 T. versicolor. Исследования показали, что по отношению к температуре роста штамм TyvF. оfficinalis, является стенотермным, а штаммы G.a.-04 G. applanatum и В 18/ T. versicolor эвритермными.

Исследование показали, что гриб T. versicolor способен расти в широком диапазоне значений рН питательной среды – от 3,5 до 7,5. Однако максимальные значения среднесуточной скорости роста 4,95, 4,80 и 4,55 мм для штамма В 18/91 отмечены на среде со значениями рН 5,5, 6,0 и 6,5. Максимальные значения скорости роста мицелия штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum отмечены в диапазоне значений рН среды от 5,5 до 6,5 мм. Рост не наблюдается при значением рН 3,5 и ниже, а для штамма F. оfficinalis и при 7,5.

Интенсивность развития грибов достоверно можно оценить по накоплению биомассы мицелия при выращивании на жидких питательных средах, т.к. на агаризованных питательных средах при равном диаметре колонии значительно отличаются по плотности и высоте. Как показали исследования, при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло, которая была использована для сравнительной характеристики штаммов, наибольшее накопление биомассы наблюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики (средний РК = 100).Так максимальное количество биомассы у штамма В 18/91 T. versicolor на 20 и 30-е сутки культивирования составило 21,70±0,28 и 23,01±0,54 г/л, тогда как у базидиомицетов G. аpplanatum и F. оfficinalis – 15,95±0, и 4,84±0,11 г/л, соответственно (рисунок 4).

Рисунок 4 – Динамика накопления биомассы мицелия чистой культуры базидиомицетов при жидкофазном поверхностном культивировании на пивном сусле, г/л Таким образом, при поверхностном культивировании на жидкой питательной среде неохмеленное сусло наибольшее накопление биомассы наблюдалось у штамма В 18/91 T. versicolor, что подтверждает его высокие ростовые характеристики на агаризованных питательных средах (средний РК = 100). Вторым, по интенсивности накопления биомассы мицелия, явился штамм G.a.-04 G. applanatum. Следует отметить, что извлеченная после культивирования мицелиальная пленка характеризовалась очень высокой плотностью и складчатой внутренней поверхностью. Самый низкий уровень накопления биомассы отмечен для штамма Tyv-2006 F. оfficinalis, количественный показатель биомассы которого на 40-е сутки культивирования составил лишь 5,22 г/л, но при добавлении в питательную среду 1% лиственничных опилок количество биомассы увеличилось в 2 раза.

Биохимический состав мицелия и плодовых тел базидиомицетов Большое значение для получения биомассы базидиомицетов имеет количество в нем белка, углеводов, липидов, витаминов, экстрактивных и минеральных веществ.

Биомассу мицелия для биохимического исследования наращивали путем жидкофазного культивирования на пивном сусле (4 оБ). Cодержаниt общего количества белка, углеводов и липидов определяли в мицелии 10, 20 и 30-ти суточного возраста медленно растущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 5, 10 и 15ти суточного мицелия быстро растущего штамма В 18/91 T. versicolor.

Для исследования качественного и количественного состава аминокислот, экстрактивных веществ, витаминов, золы и минерального состава в мицелии изучаемых штаммов был использован 30-ти суточный мицелий медленнорастущих штаммов Tyv-2006 F. оfficinalis и G.a.-04 G. applanatum и 15-ти суточный мицелий штамма В 18/91 T. versicolor.

Одной из важных характеристик как плодовых тел, так и мицелия грибов является содержание экстрактивных веществ, которое дает возможность установить качество экстракта получаемого растительного сырья. Известно, что процесс извлечения экстрактивных веществ зависит от ряда факторов, таких как состав сырья, продолжительность экстракции и температура (Государственная фармакопея, 1989; Краснюк и др., 2006). Исследования показали, что суммарный выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел зависит от температуры и условий экстракции. Так, при температуре 20-22 оС количество экстрактивных веществ значительно ниже, чем при С. Время экстракции также влияет на выход экстрактивных веществ: так в условиях исчерпывающей экстракции (при 100 оС в течение 24-72 часов) повышается выход экстрактивных веществ из мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов. Причем, количество экстрактивных веществ в мицелии гриба T. versicolor увеличивается в условиях исчерпывающей экстракции, по сравнению с холодной экстракцией в раз. Тогда как для всех остальных исследуемых образцов это соотношение составило 1:2 или 1:3 (таблица 2).

Таблица 2 – Количество экстрактивных веществ в мицелии и плодовых телах высших базидиомицетов полученных путем холодной (1), горячей (2) и исчерпывающей (3) экстракции, % Базидиомицет F. officinalis 40,96±0,33 51,09±0 71,58±1,12 3,59±0,07 8,36±0,20 8,48±0, G. applanatum 10,81±0,06 20,03±0,21 34,31±0,08 5,94±0,24 10,96±0,41 20,03±0, T. versicolor 3,39±0,16 15,30±0,04 23,33±0,35 3,56±0,13 8,92±0,27 18,45±0, Из представленной таблицы видно, что количество экстрактивных веществ в мицелии максимально у штамма F. officinalis, тогда как в плодовом теле – у гриба G.

applanatum.

Исследования по определению общего содержания белка показали, что наибольшее количество общего белка содержится в биомассе мицелия штамма Tyv- F. officinalis и с возрастом оно увеличивается и на 10, 20 и 30-е сутки культивирования и составляет 12,05, 14,34 и 15,68 %, соответственно. Содержание общего белка в мицелии этого гриба в 10 раз больше, чем в плодовых телах, количество которого составляет только 1,53 %. Полученные результаты по содержанию белковых веществ в плодовых телах F. officinalis согласуются с литературными сведениями (Ооржак и др., 2004; 2006), согласно которых количество белковых веществ зависит от возраста плодовых тел, и составляет от 4,84 до 1,39 %.

Доля общего белка в мицелии гриба G. applanatum на 10, 20 и 30-е сутки культивирования составляет 8,28, 10,03 и 10,74 %, соответственно, тогда как доля общего белка в плодовых телах составляет 9,95 %, т.е. количественные показатели доли общего белка в мицелии и плодовых телах гриба мало различаются. Незначительно с возрастом изменяется доля общего белка в мицелии гриба T. versicolor. Так после 5, 10 и 15-ти суток культивирования на пивном сусле количество общего белка в мицелии составило 13,04, 13,86 и 14,63 % соответственно, а в плодовых телах гриба T. versicolor доля белка составляет 7,25 %, что почти в два раза ниже, чем в мицелии.

Сравнительная оценка аминокислотного состава мицелия и плодовых тел всех изучаемых базидиомицетов показала, что в исследуемых образцах содержание аминокислот в мицелии превышает таковое в плодовых телах. Причем среди незаменимых аминокислот в мицелии исследуемых базидиомицетов преобладают такие как изолейцин, лейцин и тирозин, тогда как в плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor – лейцин и тирозин, а в плодовых телах F. officinalis изолейцин, лейцин, тирозин, треонин и валин. Общее количество незаменимых аминокислот от общей суммы аминокислот в чистой культуре мицелия грибов G. applanatum, F.

officinalis и T. versicolor составляет 25,4, 34,8 и 23,9%, тогда как в плодовых телах – 20,2, 37,0 и 34,6%, соответственно. Полученные данные свидетельствуют о том, что только в плодовых телах гриба T. versicolor содержание незаменимых аминокислот от общего количества аминокислот превосходит почти на 30% этот показатель в мицелии. Среди заменимых аминокислот, как в мицелии, так и в плодовых телах большое количество гистидина, аспарагиновой и глютаминовой кислот.

Биологическую активность многих грибов связывают с наличием в них углеводов, в том числе гликанов, гетерогликанов, гликозаминогликанов. По современным представлениям углеводы цитозоля клеток грибов, выполняют множество функций (Феофилова, 1997; Щерба, 2004).

Изучение биохимического состава штаммов базидиомицетов показало, что наибольшее количество общего количества полисахаридов в мицелии изучаемых штаммов выявлено у гриба T. versicolor, причем количество легкогидролизуемых углеводов в мицелии значительно отличается от количества трудногидролизуемых углеводов. Количество легко- и трудногидролизуемых углеводов в мицелии различного возраста штаммов G. applanatum и T. versicolor различается недостоверно. У гриба F.

officinalis, напротив, количество как легкогидролизуемых, так и трудногидролизуемых полисахаридов возрастает при культивировании штамма (таблица 3).

Таблица 3 – Доля углеводов в мицелии изучаемых базидиомицетов различного возраста, % Продолжительность культивирования штамма, сут Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Сравнительный анализ доли углеводов в плодовых телах изучаемых базидиомицетов показал, что плодовые тела гриба T. versicolor содержат наибольшее количество легко- и трудногидролизуемых углеводов, тогда как плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и F. officinalis характеризуются более низким содержанием общего количества углеводов, суммарный выход составил соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 % (таблица 4).

Таблица 4 – Содержание углеводов в плодовых телах базидиомицетов, % Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Таким образом, наиболее перспективным источником, не менее ценных по сравнению с белками, веществ углеводной природы является мицелий всех изучаемых штаммов, которые могут представлять интерес для создания биологически активных добавок, а также с целью обогащения кормов для сельскохозяйственных животных. Кроме того, олигосахариды могут являться биологически активными соединениями, обладающими противоопухолевой и антимикробной активностью (Чхенкели, 1998; 2005).

Важное место среди биологически активных веществ занимают липиды, причем их ценность тем выше, чем больше в их составе важных в биологическом отношении фосфолипидов. Проведенные исследования по определению количества общих липидов в мицелии изучаемых штаммов показали довольно широкий диапазон данных (от 1,02 до 7,47 % от а.с.с.). Содержание общего количества липидов в мицелии гриба F. officinalis значительно различается от возраста культуры. Так 10-суточный мицелий содержит общую долю липидов в 2,5 раза меньше, чем 30-ти суточная культура штамма. Содержание липидов в мицелии базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor в зависимости от возраста различается незначительно (таблица 5).

Таблица 5 – Содержание липидов в мицелии базидиомицетов, % Продолжительность штамма, сутки Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Из представленной таблицы видно, что общей закономерностью является преобладающее количество нейтральных липидов в составе общей фракции мицелия всех изучаемых штаммов различного возраста. Причем четкой тенденции к увеличению или уменьшению их количественного показателя с возрастом не прослеживается.

Количество гликолипидов значительно изменяется в зависимости от возраста культуры у гриба F. officinalis. Так, 10-ти суточный мицелий содержит на 40 % гликолипидов меньше, чем 30-ти суточный мицелий. Содержание гликолипидов у базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor в зависимости от возраста различается недостоверно.

На долю фосфолипидной фракции 30-ти суточного мицелия гриба F. officinalis приходится лишь 3,9 %, что в 3 раза больше, чем его доля в 10-ти суточном мицелии гриба. Наиболее высоким синтезом фосфолипидов характеризовались культуры мицелия грибов T. versicolor и G. applanatum. Причем, содержание фосфолипидов в мицелии гриба G. applanatum и T. versicolor изменяется с возрастом примерно на 30%.

Сравнительный анализ количественного определения доли общих липидов в плодовых телах изучаемых базидиомицетов показал, что отличительной чертой гриба F. officinalis является высокое содержание в его плодовых телах – 29,3 %, тогда как плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor содержат лишь 4,14 и 1,90 %, соответственно (таблица 6).

Таблица 6 – Содержание липидов в плодовых телах базидиомицетов, % Fomitopsis officinalis Ganoderma applanatum Trametes versicolor Из представленной таблицы видно, что наибольшее количество фосфолипидов содержат плодовые тела гриба T. versicolor. Количественный показатель в 10 и 2, раза выше, чем содержание таковых у базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum, соответственно. Таким образом, по количеству общих липидов и фосфолипидов, для практического использования в различных отраслях народного хозяйства (пищевой, фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и др.), мицелий базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor может представлять большую значимость.

Одним из наиболее важных компонентов плодовых тел F. officinalis является агарициновая кислота. Последние исследования зарубежных авторов доказывают, что агарициновая кислота является соединением, которое индуцирует проницаемость митохондрий путем связывания с аденин-нуклеотидтранслоказой, т.е. может использоваться при раковых новообразованиях (Гаврилин и др., 2006). Проведенный сравнительный анализ УФ-спектроскопии образца мицелия F. officinalis 30-ти суточного возраста и стандартного образца агарициновой кислоты (Sigma OLDRICH, Германия) показал идентичность спектров опытного и стандартного образцов (рисунок 5).

Полученные нами результаты не согласуются с данными О.М. Ефименко (1965), которая отмечала, что 30-40-суточный мицелий Fomitopsis officinalis не содержит агарициновой кислоты. Следовательно, мицелий Fomitopsis officinalis может быть использован для получения биологически активного соединения агарициновой кислоты.

Рисунок 5 – Уф-спектры раствора порошка, полученного из мицелия гриба Fomitopsis officinalis и стандартного образца, и стандартного образца агарициновой кислоты Перспективным биотехнологическим способом получения мицелия грибов – продуцентов биологически активных веществ может быть твердофазная ферментация растительных материалов. Для массовой наработки биомассы грибов необходимым этапом исследований является подбор дешевых и экологически безопасных растительных субстратов. В этой связи перспективным источником сырья для ферментации могут служить отходы деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства. Как показали результаты исследования, для всех изучаемых штаммов лучшим субстратом для культивирования явилось измельченное зерно пшеницы, тогда как на гидролизном лигнине рост не был отмечен. Штамм гриба F. officinalis утилизировал лиственничные опилки и кору пихты, а штамм гриба T. versicolor утилизировал кору, древесную зелень пихты и лиственничные опилки. Скорость роста штаммов и характер формирования воздушного мицелия на различных субстратах были не одинаковы. Изучаемый штамм гриба G. applanatum не утилизировал отходы деревообрабатывающей и гидролизной промышленности.

Проведенный факторный эксперимент с использованием различных композиций из субстратов показал, что для наращивания мицелия пштамма-продуцента F. officinalis необходимо использовать композицию растительного субстрата, где доля лигнина 60%, древесной зелени пихты и коры пихты по 20%; для штамма гриба T.

versicolor субстраты, где доля лигнина 20%, древесной зелени пихты и коры пихты по 40%.

Изучение токсичности и зоопатогенности штаммов-продуцентов биологически активных веществ, является обязательным условием для возможности их рекомендации в массовое производство. Водные экстракты из мицелия и плодовых тел F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor отнесены к классу нетоксичных. Культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма, штаммов G.a.-04 G. applanatum и В 18/91 T. versicolor являются нетоксичными, тогда как метаболиты штамма Tyv- F. officinalis – высокотоксичные.

Исследование химического состава метаболитов штамма Tyv-2006 F. officinalis методом хромато-масс-спектрометрии показало высокое содержание нервного яда – гидроксиметилфурфурола, количество которого в образцах составляет 60,04 % что, возможно, и определяет их токсичность.

Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия и плодовых Многие макромицеты являются продуцентами широкого спектра антибиотиков и препаратов противоопухолевого и иммуномодулирующего действия. Повышенному интересу к грибам этой группы способствовали многочисленные исследования, показавшие, что они могут стать незаменимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих антимикробную активность (Низковская, 1983; Бухало и др., 1996; Даниляк, 1996; Чхенкели, 1998; 2006; Sliva, 2006; Ziegenbein et.al., 2006;

Gao et.al., 2002; Ikewawa, 2003; Jeong et.al., 2008 и другие).

В настоящее время часто при инфекционных заболеваниях различной этиологии используются лекарственные средства, обладающие либо крайне низкой активностью, либо имеющие высокий процент резистентности в отношении основных возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний. В связи с этим весьма актуальна задача поиска новых продуцентов антибиотических веществ и препаратов, активных в отношении микроорганизмов, имеющих множественную лекарственную устойчивость (Сидоренко, 2002; Яковлев, 2002). Изучение антимикробной активности водных экстрактов из мицелия показало, что все тест-культуры оказались чувствительными к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.

versicolor. Водный экстракт из мицелия G. applanatum обладает антимикробной активностью в отношении всех взятых для эксперимента тест-культур, кроме микроорганизмов рода Staphylococcus, из мицелия лиственничной губки обладает антимикробной активностью в отношении S. aureus, B. subtilis, P. aeruginosa 114, E. coli k-12, S. typhimurium, L. monocytogenes и C. freundii (таблица 7).

Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял среднюю степень антимикробной активности к микроорганизмам S. aureus, S. typhimurium и C.

freundii. Тогда как, среди тест-культур обладающих средней чувствительностью к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия штамма G.a.-04 G. applanatum оказались лишь C. albicans и B. subtilis. Остальные тесткультуры показали слабую чувствительность к исследуемым экстрактам. Следует отметить, что степень активности водных экстрактов из мицелия штамма В 18/91 T. versicolor, оценивается как средняя ко всем тест-культурам, за исключением микроорганизмов E. coli k-12, L. monocytogenes и Citrobacter freundii, где зоны вокруг лунок были менее 12 мм в диаметре, что свидетельствует о слабой чувствительности штаммов к биологически активным соединениям, экстрагируемым водой из мицелия гриба T.

versicolor.

Исследование культуральных жидкостей изученных грибов F. officinalis, G.

аpplanatum и T. versicolor, покзали, что антимикробную активность в отношении всех используемых в эксперименте тест-культур проявляют только метаболиты F.

оfficinalis. Следует отметить, что метаболиты гриба F. officinalis обладающие антимикробной и фунгицидной активностью, являются высокотоксичными.

Таблица 7 – Антимикробная активность водных экстрактов из мицелия изучаемых базидиомицетов Staphylococcus aureus Staphylococcus cohnii Staphylococcus epidermidis Staphylococcus warneri Staphylococcus haemolyticus Candida albicans Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa Escerichia coli k- Salmonella typhimurium Listeria monocytogenes Citrobacter freundii Примечание: « – » - активность не выявлена Водные экстракты из плодовых тел гриба T. versicolor оказывают антимикробную активность в отношении грамположительных стафилококков, в частности коагулазоположительного S. aureus и коагулазоотрицательного S. haemolyticus, тогда как действия экстрактов из плодовых тел базидиомицетов F. officinalis и G. applanatum в их отношении не выявлено.

Полученные данные свидетельствуют о том, что культуры исследуемых базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы как продуценты биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью.

Противоопухолевые свойства водных экстрактов из мицелия и плодовых Повышенному интересу к дереворазрушающим базидиомицетам способствовали многочисленные исследования, показавшие, что эти организмы могут стать незаменимыми источниками для получения лекарственных препаратов, имеющих иммуномодулирующую и противоопухолевую активность. Наиболее активными считаются полисахариды, стероидные соединения и каротиноидные пигменты, проявляющие модифицирующее действие на активность клеток врожденного иммунитета (Краснопольская, 2007; Феофилова, 1996; 2006; Щерба и др., 2007; Cui et.al, 2003; Cao et.al., 2004; Jiang te.al., 2007; Muller et.al., 2006; Sliva, 2006; Moradali et.al., 2006). Исследование показало, что водные экстракты мицелия и плодовых тел всех изучаемых штаммов базидиомицетов, в той или иной степени оказывают цитопатическое действие на опухолевые клетки АКЭ. Результаты исследования in vivo, проведенные на мышах линии ICR, показали, что водные экстракты мицелия F. officinalis и плодового тела G. аpplanatum обладали выраженной противоопухолевой активностью. Объем и концентрация живых клеток опухоли достоверно снижался по сравнению с группой мышей, получавших противоопухолевый препарат циклофосфан, и с контрольной группой мышей, не получавших препараты.

Наиболее выраженное достоверное торможение роста опухоли (ТРО) регистрируется при введении экстракта из мицелия F. officinalis и составляет 77 %. Полученные данные о противоопухолевом действии сибирских штаммов базидиомицетовых грибов открывают новые возможности и перспективы использования в комплексной терапии рака биологически активных веществ, получаемых из биомассы мицелия продуцентов.

ВЫВОДЫ

1. В результате лабораторных исследований in vitro установлены культуральноморфологические признаки и особенности роста Fomitopsis officinalis, Ganoderma applanatum и Trametes versicolor. К быстро растущим отнесены штаммы T. versicolor, медленно растущим – F. officinalis и G. applanatum. По особенностям роста в различном интервале температур F. оfficinalis относится к стенотермным видам (25-30 оС), а G. applanatum и T. versicolor (15-25 оС) к эвритермным. Оптимальным рН для роста всех изучаемых штаммов является 5,5-6,5. По показателям ростового коэффициента и скорости роста проведен отбор продуктивных штаммов Fomitopsis officinalis Tyv- (ВКПМ F-968) и Ganoderma applanatum G.a.-04 (ВКПМ F-983).

2. Относительное содержание белка в мицелии грибов F. officinalis и T. versicolor увеличивается в процессе культивирования; доля общего белка в биомассе мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis в 10 раз превосходит его содержание в плодовых телах.

Содержание белка в мицелии грибов G. applanatum и T. versicolor при культивировании изменяется незначительно; доля общего белка в мицелии штамма T. versicolor почти в два раза выше, чем в плодовых телах. В мицелии штамма G.a.-04 G. applanatum содержание белка на 10 % выше, чем в плодовых телах.

Качественный состав аминокислот белка мицелия базидиомицетов характеризуется преобладанием незаменимых аминокислот изолейцина, лейцина и тирозина. В плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor – обнаружены - лейцин и тирозин, а в плодовых телах F. officinalis - изолейцин, лейцин, тирозин, треонин и валин.

3. При культивировании изученных грибов возрастает количество трудногидролизуемых (37,63±0,98) и легкогидролизуемых (13,14±0,19) полисахаридов у штамма F. officinalis, у штаммов G. applanatum и T. versicolor эти различия не обнаружены.

Наибольшее количество легко- и трудногидролизуемых углеводов содержат плодовые тела гриба T. versicolor, плодовые тела базидиомицетов G. applanatum и F. officinalis характеризуются более низким содержанием общего количества углеводов, составляющее соответственно – 50,7, 23,2 и 12,63 %.

4. В процессе культивирования всех изученных штаммов изменяется общее содержание липидов в мицелии, причем в составе общей фракции мицелия различного возраста преобладали нейтральные липиды. Содержание липидов, как в мицелии, так и в плодовых телах базидиомицетов G. applanatum и T. versicolor различалось незначительно, их соотношение составило 1:1. Доля общих липидов в плодовых телах гриба F. officinalis в 4 раза выше, чем в биомассе мицелия. В липидной фракции мицелия и плодовых тел F. оfficinalis идентифицирована агарициновая кислота.

5. Штаммы грибов различаются характером и скоростью роста на различных питательных субстратах. Увеличение выхода биомассы медленно растущего штамма Tyv-2006 F. оfficinalis достигалось после обогащения питательной среды лиственничными опилками.

6. Штаммы базидиомицетов F. officinalis, G. applanatum и T. versicolor могут быть использованы в качестве продуцентов биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Антимикробной активностью в отношении грамположительных стафилококков отличались водные экстракты из биомассы мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor и культуральная жидкость штамма Tyv-2006 F. оfficinalis. Противокандидозной активностью обладали водные экстракты мицелия T. versicolor и G.

applanatum. Водный экстракт из мицелия штамма Tyv-2006 F. officinalis проявлял избирательное действие в отношении к микроорганизмов.

7. Водные экстракты мицелия всех изученных штаммов и культуральные жидкости, содержащие продукты метаболизма штаммов G. applanatum и T. versicolor, не являются токсичным для теплокровных животных, тогда как метаболиты культуральной жидкости штамма F. оfficinalis высокотоксичны.

8. В опытах in vitro установлено, что водные экстракты из мицелия и плодовых тел гриба T. versicolor оказывают прямое цитопатическое воздействие на опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха, тогда как экстракты из мицелия штаммов G. applanatum и F. оfficinalis – длительное цитопатическое действие. В опытах in vivo наиболее выраженное достоверное торможение роста опухоли оказывает водный экстракт из мицелия лиственничной губки (F. officinalis).

Для культивирования мицелия штаммов F. оfficinalis и T.

versicolor.разработаны оптимальные композиции растительных субстратов с использованием отходов промышленности лесоперерабатывающего комплекса. Лучшим субстратом для твердофазного культивирования мицелия исследованных штаммов базидиомицетов G. applanatum, F. оfficinalis и T. versicolor является измельченное зерно пшеницы. Полученная биомасса базидиомицетов может быть использована для получения биологически активных веществ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Чижмотря Н.М., Гаврилова А.Г., Громовых Т.И., Новицкий И.А. Антимикробная активность грибов рода Trichoderma и Trametes в отношении патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus // Сибирский медицинский журнал. – Иркутск, 2006. – Т. 66, №8. – С. 18-20.

2. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета G.a.-04 Ganoderma applanatum (Pers. ex Wallr.) Pat // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2008. - №1. – С. 70-73.

3. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета Tyv-2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bond. et Singer // Вестник КрасГАУ. – Красноярск, 2009. - №1. – С. – 68-75.

4. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Изучение биологической активности и продуктивности на растительных субстратах сибирского штамма базидиомицета Trametes versicolor (L. Ex Fr.) Lloyd // Материалы Всероссийской конференции студентов и аспирантов по приоритетному направлению «Рациональное природопользование». – Ярославль, 2006. – С. 260-262.

5. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирских штаммов базидиомицетов // Материалы Международной школыконференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» – Москва-Пущино, 2006.

– С.130-131.

6. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Новые альтернативные пути получения биологически активных веществ // Материалы городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска». – Красноярск, 2007. – С. 74-76.

7. Ковалева Г.К., Громовых Т.И. Перспективы создания новых биотехнологий на основе сибирского штамма B 18/91 базидиомицета Trametes versicolor // Материалы II Международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем». – Владивосток, 2007. – С.55-57.

8. Громовых Т.И., Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Гаврилова А.Г. Противоопухолевые свойства макро- и микромицетов Средней Сибири // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М: Национальная академия микологии. – 2008. – С. 517.

9. Громовых Т.И., Садыкова В.С., Ковалева Г.К., Кутафьева Н.П., Гайдашева И.И., Миронов А.Г., Пашенова Н.В. Коллекция чистых культур макро- и микромицетов средней Сибири – база для создания новых биотехнологий и образовательного процесса // Современная микология в России. Тезисы докладов второго съезда микологов России. М:

Национальная академия микологии. – 2008. – С. 109-110.

Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Громовых Т.И., Инжеваткин Е.В. Биология, культивирование и лекарственные свойства Trametes versicolor // Высшие базидиальные грибы: индивидуумы, популяции, сообщества. Материалы юбилейной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.В. Горленко. М.: ВостокЗапад, 2008. – С. 190-191.

Патент 2007147074/13 (051610) RU МПК7 C12N 1/14 Штамм базидиомицета Fomitopsis officinalis ВКПМ F - 961, используемый для получения противоопухолевых препаратов / Т.И. Громовых, В.С. Садыкова, Е.В. Инжеваткин, Г.К. Ковалева, Л.И. Черепанова; заявл. 17.12.07 г.



Похожие работы:

«Пьянков Кирилл Сергеевич ЧИСЛЕННОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЙ ИДЕАЛЬНОГО ГАЗА И ДВУХФАЗНЫХ СМЕСЕЙ ГАЗА С ЧАСТИЦАМИ 01.02.05 – механика жидкости, газа и плазмы 05.13.18 – математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Центральный институт авиационного моторостроения имени П.И....»

«ЧИРКОВА Вера Михайловна РАЗВИТИЕ АНАЛИТИЧЕСКИХ УМЕНИЙ У СТУДЕНТОВ-МЕДИКОВ В ПРОЦЕССЕ ИЗУЧЕНИЯ РУССКОГО ЯЗЫКА КАК ИНОСТРАННОГО ПРИ ПОДГОТОВКЕ К КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ 13.00.08 – теория и методика профессионального образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата педагогических наук Курск 2011 Работа выполнена на кафедре методики преподавания иностранных языков Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«ЯНОВ Владимир Иванович ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ УРОЖАЯ РАЗНЫХ ВИДОВ ПОЛЫНИ И НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ПОЛЫНИ ЭСТРАГОННОЙ НА СВЕТЛО-КАШТАНОВЫХ СОЛОНЦЕВАТЫХ ПОЧВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ПРИКАСПИЯ 06.01.01 – Общее земледелие АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Ставрополь – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Калмыцкий государственный университет в 1991–2008 гг. Научный консультант : доктор сельскохозяйственных наук...»

«Полуэктова Мария Михайловна МЕТОД ОЦЕНКИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА АВТОМОБИЛЬНЫМ ТРАНСПОРТОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕОИНФОРМАЦИОННЫХ СИСТЕМ Специальность: 25.00.30 - метеорология, климатология, агрометеорология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в государственном учреждении Главная геофизическая обсерватория им. А. И. Воейкова Научный руководитель : Заслуженный деятель науки РФ, доктор...»

«ВЯТКИНА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА ДОГОВОРНЫЕ ОТНОШЕНИЯ ПРЕДПРИНИМАТЕЛЬКИХ ОРГАНИЗАЦИЙ В СФЕРЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА Специальность 12.00.03 – гражданское право: предпринимательское право; семейное право; международное частное право Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Казань 2002 Работа выполнена на кафедре гражданского права и процесса Казанского государственного университета имени В.И. УльяноваЛенина Научный руководитель -...»

«Борников Александр Вячеславович Биологическая продуктивность березы повислой в градиенте загрязнений от Карабашского медеплавильного комбината 06.03.02 Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Екатеринбург – 2012 Электронный архив УГЛТУ Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Уральский государственный лесотехнический университет Научный руководитель : доктор...»

«Григорьева Ольга Вадимовна МОРФОГЕНЕЗ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ВОЛОСКОВ У РАСТЕНИЙ РОДА DRABA (КРУПКИ) 03.03.05 – биология развития, эмбриология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре биологической эволюции Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : доктор биологических наук, Черданцев Владимир Георгиевич профессор...»

«ФИЛИМОНОВА Наталья Владимировна ФРАЗЕОЛОГИЗМЫ, НОМИНИРУЮЩИЕ ЧЕЛОВЕКА ПО ЧЕРТАМ ХАРАКТЕРА, В РУССКОМ И НЕМЕЦКОМ ЯЗЫКАХ: СТРУКТУРНЫЙ И СЕМАНТИЧЕСКИЙ АСПЕКТЫ Специальность 10.02.20 – Сравнительно-историческое, типологическое и сопоставительное языкознание АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Челябинск, 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Челябинский государственный...»

«ФОКИНА Анна Ивановна ВЛИЯНИЕ СВИНЦА НА СТРУКТУРУ ФОТОТРОФНЫХ МИКРОБНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВЫ 03.00.16. – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института биологии Коми НЦ УрО РАН и Вятского государственного гуманитарного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Домрачева Людмила Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ЧЕРНОВА ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА БИОГЕНЕЗ ФЛОЭМНЫХ ВОЛОКОН КОНОПЛИ (Cannabis sativa L.) И ЛЬНА (Linum usitatissimum L.): СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ 03.00.12 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2007 2 Работа выполнена в лаборатории механизмов роста растительных клеток Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук. Научные руководители: доктор биологических...»

«Дмитриева Юлия Ивановна РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕГИОНАЛЬНОЙ ЭЛЕКТРОЭНЕРГЕТИКИ Специальность 05.14.01 – Энергетические системы и комплексы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Нижний Новгород – 2007 Работа выполнена на кафедре Электроэнергетика и электроснабжение ГОУ ВПО Нижегородский государственный технический университет (НГТУ) им. Р.Е. Алексеева доктор технических наук, профессор Научный руководитель : Папков...»

«КОЛУПАЕВ АЛЕКСЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ Почвенные микроорганизмы-биодеструкторы органических пестицидов 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2010 г. Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Вятский государственный гуманитарный университет, г. Киров (ГОУ ВПО ВятГГУ) и...»

«Дьяков Алексей Сергеевич ПОВЫШЕНИЕ ДЕМПФИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ПОДВЕСОК АТС ПУТЕМ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ И ХАРАКТЕРИСТИК РЕЗИНОКОРДНЫХ ПНЕВМАТИЧЕСКИХ РЕССОР 05.05.03 – Колёсные и гусеничные машины АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук Волгоград – 2009 2 Работа выполнена в Волгоградском государственном техническом университете Научный руководитель доктор технических наук, доцент Новиков Вячеслав Владимирович. Официальные оппоненты : доктор...»

«ФАН МИ ХАНЬ БИОТЕХНОЛОГИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА GLUCONACETOBACTER HANSENII GH – 1/2008 Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре Химия пищи и пищевая биотехнология Института прикладной биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«Томин Павел Юрьевич МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ФИЛЬТРАЦИИ В ТРЕЩИНОВАТЫХ СРЕДАХ 05.13.18 — Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва 2011 2 Работа выполнена на кафедре плазменной энергетики факультета проблем физики и энергетики Московского физико-технического института. Научный руководитель : кандидат физико-математических наук, доцент...»

«Худойбердиев Хуршед Атохонович КОМПЛЕКС ПРОГРАММ СИНТЕЗИРОВАНИЯ ТАДЖИКСКОЙ РЕЧИ ПО ТЕКСТУ 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук ДУШАНБЕ – 2009 Работа выполнена в Худжандском филиале Технологического Университета Таджикистана Научный руководитель :доктор физико–математических наук, академик АН РТ, профессор Усманов Зафар Джураевич Официальные...»

«ИРИСХАНОВА Зазу Имрановна ЕСТЕСТВЕННАЯ ДЕНДРОФЛОРА ЧЕЧЕНСКОЙ РЕСПУБЛИКИ И ЕЁ АНАЛИЗ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Астрахань 2009 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО Чеченский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Иванов Александр Львович Официальные оппоненты : доктор географических наук, профессор Бармин Александр Николаевич кандидат биологических наук, доцент...»

«ЗИАДИН ДИЯ САМИ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СИСТЕМАХ ОСНОВНОЙ ОБРАБОТКИ ПОЧВЫ В ЗАСУШЛИВЫХ УСЛОВИЯХ ИОРДАНИИ Специальность 06.01.01 – общее земледелие Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Москва – 2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов. Научный руководитель : кандидат технических наук, профессор Тагасов Виктор Иванович Официальные...»

«Ванкович Александр Юрьевич Акмеологические знания в системе управления организационными отношениями Специальность 19.00.13 – психология развития, акмеология (психологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата психологических наук Москва-2013 Работа выполнена на кафедре акмеологии и психологии профессиональной деятельности Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российская...»

«ЯЛУНИНА Екатерина Николаевна КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТЬ РОЗНИЧНОГО ТОРГОВОГО ПРЕДПРИЯТИЯ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством – Экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами сферы услуг АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Екатеринбург - 2007 PDF wurde mit FinePrint pdfFactory Pro-Prufversion erstellt. www.context-gmbh.de Работа выполнена на кафедре экономики и управления в...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.