WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

1

на правах рукописи

УДК 533.9

КРЫНДУШКИН ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ПРИОННЫЙ ДЕТЕРМИНАНТ [PSI+] ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES

CEREVISIAE : СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ

ПОДДЕРЖАНИЯ.

03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Михаил Давидович Тер-Аванесян

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Андрей Борисович Вартапетян кандидат физико-математических наук Роберт Шавлович Бибилашвили

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится 2004 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение. Актуальность проблемы. Термин “прион” появился в связи с исследованием ряда дегенеративных заболеваний центральной нервной системы, таких как скрейпи овец, "болезнь бешенства" коров и болезнь Крейцфельда-Якоба человека.

Интерес к изучению данных заболеваний сильно возрос в последние годы из-за участившихся случаев заражений людей при потреблении внутрь мяса больных животных. Несмотря на то, что у животных эти заболевания описаны около двухсот лет назад, а у человека в начале этого века, их природа оставалась непонятной вплоть до последнего времени. Необычна этиология этих заболеваний: они могут возникать спорадически, могут наследоваться, а также передаваться инфекционным путем. В была предложена «белковая» гипотеза, согласно которой инфекционный агент (получивший название "прион") представляет собой обычный клеточный белок, находящийся в особом конформационном состоянии, которое способно к самоподдержанию при помощи автокаталитического механизма. Эта революционная гипотеза получила в настоящее время солидное экспериментальное подтверждение.

В 1994 году появилась работа (Wickner, Science, 1994), предсказывающая существование прионов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). В дальнейшем эта гипотеза получила многочисленные генетические и биохимические подтверждения. В частности, было показано, что генетический детерминант дрожжей [PSI+] представляет собой прионную форму белка Sup35. Был создан гибридный прионный детерминант [PSI+PS] на основе прионного состояния белка Sup35 из дрожжей Pichia methanolica (P.

methanolica). Это позволило доказать консервативность прионных свойств белка Sup35.

Однако по-прежнему остается невыясненной структурная организация прионных частиц, а также клеточные механизмы, контролирующие репликацию прионов в клетках дрожжей.

Цели и задачи исследования. Предлагаемая работа посвящена разработке дрожжевой модели для исследования репликации прионов на молекулярном уровне и использованию ее для изучения механизмов элиминации детерминантов [PSI+] и [PSI+PS].

В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1) Идентифицировать белки, существенные для поддержания детерминантов [PSI+] и [PSI+PS] в клетках S. cerevisiae, и выяснить механизмы их участия в этом процессе.

2) Разработать биохимические подходы, позволяющие определить структурную организацию прионных частиц в клетках S. cerevisiae и оценить влияние различных воздействий на структуру прионных агрегатов детерминантов [PSI+] и [PSI+PS].

Научная новизна. В работе был впервые проведен систематический поиск белков, участвующих в поддержании прионных детерминантов [PSI+] и [PSI+PS] у дрожжей S. cerevisiae. Было выявлено несколько эволюционно-консервативных белковшаперонов из семейств Hsp70 и Hsp40, присутствующих как у дрожжей, так и у млекопитающих, что позволяет предполагать возможность использования регуляции экспрессии этих белков для лечения прионных болезней человека. Кроме того, было обнаружено, что другие идентифицированные белки влияют на стабильность детерминантов опосредованно, регулируя экспрессию шаперонов на уровне транскрипции.

Разработан оригинальный метод очистки и анализа дрожжевых прионов, который позволил получить новые данные о структурной организации прионных агрегатов и установить их размер, а также позволил обнаружить различия между штаммами прионного детерминанта на молекулярном уровне. Данный метод был применен для анализа механизмов действия различных факторов, вызывающих элиминацию прионных детерминантов [PSI+] и [PSI+PS], таких как уменьшение количества шаперона Hsp104, добавление в среду для роста дрожжей низких концентраций гидрохлорида гуанидина (GuHCl), сверхэкспрессия шаперона Sis1.

Практическое значение работы. Изучение прионных заболеваний на моделях трансгенных животных встречает ряд технических трудностей. Использование дрожжей S.

cerevisiae в качестве модельного объекта значительно облегчает изучение общих механизмов, присущих явлению прионов, так как дрожжи представляют собой наиболее удобный для молекулярно-генетического анализа эукариотический организм. Полученные результаты могут быть использованы в будущем для разработки стратегии лечения прионных заболеваний человека и животных.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ (2004), XXI Международной конференции по дрожжевой генетике и молекулярной биологии (Gothenburg, 2003), III Конгрессе Российского Биохимического Общества (СанктПетербург, 2002), 2й Международной конференции по прионам дрожжей (Calistoga, 2002), XLIII Научной Конференции МФТИ (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 6 тезисных сообщений.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 126 страницах и включает 24 рисунка, 8 таблиц и список литературы, содержащий 156 ссылок.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы состоит из трех разделов. Первый посвящен прионам млекопитающих, во втором рассмотрены прионы низших эукариот, в третьем были проанализированы результаты исследований клеточных факторов, влияющих на поддержание прионного состояния белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали следующие штаммы дрожжей S. cerevisiae: 5V-H19 (MATa ade2-1 SUQ5 can1-100 leu2-3,112 ura3-52, состояние [PSI+] или [psi-]), PS-5V-H19 (был получен из 5V-H19 замещением гена SUP35 гибридным геном SUP35-PS, который кодирует белок Sup35-PS, содержащий 1-186 аминокислот белка Sup35 дрожжей P.

methanolica и 124-686 аминокислот белка Sup35 дрожжей S. cerevisiae; состояние [PSI+PS] или [psi-PS]). В работе использовали стандартные методы генетики дрожжей (метод селективных сред, трансформация), а также стандартные молекулярно-биологические методы (конструирование плазмид, гибридизация по Саузерну, экспрессия белков в E.

coli, SDS-PAGE электрофорез и иммуноблоттинг, ультрацентрифугирование, ДНКбелковое связывание). Часть биохимических методов была разработана в данной работе (очистка прионных полимеров Sup35, SDD-AGE). Часть дрожжевых плазмид, использованных в работе, были любезно предоставлены В.В. Кушнировым, M. Tuite, H.

Ruis, остальные сконструированы автором. Антитела к шаперонам были любезно предоставлены E. Craig, на Rpp0 – J. Ballesta. Часть работы по разработке метода SDDAGE была выполнена совместно с И.А. Александровым.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сверхэкспрессия дрожжевых шаперонов из семейства Hsp70/Hsp40 приводит к элиминации некоторых штаммов прионных детерминантов [PSI+] и [PSI+PS].

Генетическая система, основанная на супрессии нонсенс-мутацию ade2-1, позволяет визуально определять наличие детерминантов [PSI+] и [PSI+PS] в клетках дрожжей по белому цвету колоний, при этом красный цвет указывает на отсутствие детерминантов, а розовый – на ослабление их фенотипа. Эта система была использована для изучения генов, продукты которых могли бы вызывать элиминацию [PSI+] или [PSI+PS]. Единственный известный по литературным данным белок с антиприонными свойствами – шаперон Hsp104 – вызывал элиминацию только детерминанта [PSI+], но не [PSI+PS]. Мы предположили, что сверхэкспрессия генов других шаперонов дрожжей (SSA1, SSB1 и YDJ1) может повлиять на стабильность детерминанта [PSI+PS]. Для проверки этой гипотезы несколько штаммов [PSI+] и [PSI+PS], охарактеризованных по уровню нонсенс-супресии ade2-1 (цвету колоний), были трансформированы многокопийными дрожжевыми плазмидами, содержащими гены SSA1, или SSB1 или YDJ1, и контрольной плазмидой, не содержащей дополнительных генов. Эффективность элиминации [PSI+] и [PSI+PS] представлена в Таблице 1.

Систематический поиск белков, способных при сверхэкспресии приводить к элиминации детерминанта [PSI+PS].

После обнаружения влияния сверхэкспресии трех шаперонов на стабильность [PSI+PS] мы предприняли попытку систематического поиска новых белков, способных элиминировать [PSI+PS] и, возможно, [PSI+]. Для этого были использованы 2 независимо полученные библиотеки дрожжевых генов, каждая из них представляла собой набор многокопийных плазмид, содержащих случайные фрагменты дрожжевого генома. Клетки дрожжей, содержащие штамм [PSI+PS] №1, были трансформированы этими библиотеками.

В результате трансформации было обнаружено появление некоторого количества клонов красного цвета, при этом >99% трансформантов оставались белого цвета, как и исходный штамм [PSI+PS] №1. Изменение цвета некоторых колоний было также зафиксировано после трансформации этого штамма "контрольной" плазмидой, что свидетельствовало о спонтанной потере прионного детерминанта в процессе трансформации. Чтобы исключить подобные случаи, мы производили скрещивание всех трансформантов красного цвета со штаммом дрожжей, содержащим тот же самый детерминант [PSI+PS] №1. После скрещивания мы брали для дальнейшего анализа только те плазмиды, которые вызывали изменение цвета дрожжей как в гаплоидном, так и в диплоидном состоянии, что говорило о "неслучайности" наблюдаемого эффекта. Всего было проанализировано около 300 тыс. трансформантов [PSI+PS] №1, из них в конце отобрано около 40 "результативных" клонов. Из этих клонов была выделена плазмидная ДНК, которой затем трансформировали клетки E.coli. Изолированные таким образом индивидуальные плазмиды были еще раз проверены на наличие эффекта элиминации, затем секвенированы по концам вставок. При необходимости идентификацию гена, ответственного за наблюдаемый эффект, производили путем делеционного анализа вставки и сравнения с последовательностью дрожжевого генома. В этом эксперименте были найдены следующие белки: Sisl, Ynl077w, Stil – дрожжевые шапероны, участвующие в фолдинге белков; Ssn8, Sfll – регуляторы транскрипции некоторых белков; RppO - рибосомный белок (структурный компонент рибосомы). Мы проверили действие этих белков на другие штаммы [PSI+] и [PSI+PS] (Таблица 1). Потерю прионных детерминантов характеризовали по критериям: ослаблению супрессии нонсенс-мутации ade2-1, что соответствует изменению цвета колоний (ослаб. супрессии); появлению красных секторов у белых колоний; и относительному количеству появившихся клеток без детерминантов по отношению к общему количеству клеток за время роста дрожжевой колонии (частота потерь).

Таблица 1. Антиприонные эффекты идентифицированных белков.

штамм Эффекты Sis1 Adj1 Ydj1* Ssa1* Ssb1* Sti1 Sfl1 Ssn8 Rpp0 Контроль *- соответствует белкам, идентифицированным ранее Избыток транскрипционных регуляторов Ssn8 и Sfl1, делеции соответствующих генов, а также избыток Rpp0 могут влиять на профиль экспрессии шаперонов в дрожжевой клетке.

Для исследования эффектов белков Ssn8 и Sfl1 мы сконструировали штаммы с делеционными аллелями генов SSN8 или SFL1 у штамма PS-5V-H19, содержащие [PSI+PS] №1, а также аналогичные штаммы без прионного детерминанта. Делеции этих генов были сконструированы при помощи гомологичной рекомбинации фрагмента гена вместе со вставленным внутрь этого фрагмента геном URA3 в геном штамма дрожжей PS-5V-H [PSI+PS] №1. В результате интеграции этого фрагмента ДНК полученный штамм дрожжей приобретал способность расти на среде, не содержащей урацил, что позволило легко отобрать нужные колонии. Правильность сконструированных делеций была проверена с помощью гибридизации по Саузерну.

транскрипционных факторов является их участие в регуляции экспрессии шаперонов, на что указывают некоторые литературные данные. В частности, Sfl1 является гомологом Hsf1 – ключевого транскрипционного фактора, который связывается с промоторной последовательностью HSE (Heat Shock Element) и регулирует реакцию дрожжей на тепловой шок и, соответственно, синтез многих шаперонов. Это означает, что и Sfl может связываться с HSE и изменять экспрессию шаперонов в дрожжевой клетке. В свою очередь, Ssn8 является транскрипционным репрессором некоторых генов и, в частности, гена, кодирующего шаперон Ssa1. Известно, что Ssn8 быстро деградирует под воздействием разнообразных стрессов (теплового, окислительного и при голодании).

Можно предполагать, что избыток Ssn8 может изменять профиль экспрессии шаперонов в дрожжевой клетке и таким образом приводить к дестабилизации прионного детерминанта.

Для проверки этой гипотезы мы сконструировали несколько плазмид, несущих ген LacZ (бактериальная –галактозидаза) под контролем промоторов генов HSP104, SUP35 и SSA4 (представитель Hsp70), а также промоторных элементов HSE и STRE (STress Response Element), любезно предоставленных нам H. Ruis. Промотор HSP104 был взят ввиду исключительной важности этого белка для поддержания прионов в дрожжевой клетке. Экспрессия SSA4 легко активируется в ответ на разнообразные стрессовые условия, поэтому этот ген может служить чувствительным сенсором изменений вызванных стрессом, также как и элементы HSE и STRE, присутствующие в промоторах практически всех шаперонов. Об изменении уровня транскрипции генов шаперонов можно судить по изменению уровня экспрессии –галактозидазы в этой модельной системе. Исходя из этого, мы измеряли активность –галактозидазы в клетках дрожжей 5V-H19 [psi-рs] в зависимости от присутствия многокопийных плазмид с SSN8, SFL1 и RPP0, а также делеций SSN8 и SFL1 (Табл. 2).

Отметим, что полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными: избыток Sfl1 увеличивает транскрипцию с HSE-элемента, а избыток Ssn8 во многих случаях приводил к снижению уровня –галактозидазной активности (вероятно, негативно регулирует экспрессию шаперонов).

Возвращаясь к данным Таблицы 1, отметим, что шапероны из семейств Hsp70/Hsp40 (к ним относятся большинство найденных в нашей работе шаперонов) и Hsp100 (Hsp104 эффективно элиминирует [PSI+]), вероятно, являются основными белками, влияющими на поддержание прионного детерминанта в клетках дрожжей.

Действительно, действие трех других найденных в работе белков - Ssn8, Sfl1, Rpp0 – сводится, по-видимому, к модуляции профиля экспрессии шаперонов, что дестабилизирует прионный детерминант. Избыток этих белков эффективно действовал только на один штамм [PSI+PS] №1, и очень слабо действовал на другие штаммы приона (это подтверждает гипотезу о том, что разные штаммы прионного детерминанта отличаются друг от друга конформацией прионного белка).

Таблица 2. Влияние делеций SSN8 и SFL1 и сверхэкспрессии SSN8, SFL1 и RPP0 на промоторную активность указанных элементов в модельной системе: промоторный элемент – ген LacZ.

мультикопийный SSN делеция SSN мультикопийный SFL делеция SFL мультикопийный (жирным курсивом отмечены значительные изменения активности, каждое значение соответствует измерению 3 независимых трансформантов; "pro" - означает промотор, "int" - интегративная конструкция, "cen" - центромерная конструкция).

Sfl1 связывается с промоторной последовательностью HSE.

Для проверки непосредственного взаимодействия Sfl1 с HSE-элементом был проведен стандартный эксперимент по ДНК-белковому связыванию (gel mobility shift assay). Мы экспрессировали гибридный белок 6His-Sfl1 в клетках E. coli, при этом последовательность из 6 расположенных подряд гистидинов, пришитая с N-конца белка, обеспечивает связывание белка с аффинной смолой TALONTM (CLONTECH) и предположительно не влияет на функциональные свойства белка Sfl1. Затем белок 6HisSfl1 был очищен при помощи указанной аффинной хроматографии, степень очистки и определение концентрации белка производили электрофоретическим методом. После этого мы произвели связывание 6His-Sfl1 с синтетическим ДНК-дуплексом HSE, мечеными радиоактивным фосфором P32 при помощи фермента Кленова. ДНК-белковый комплекс отделяли от несвязавшихся дуплексов, используя неденатурирующий (нативный) электрофорез. Кроме этого, мы провели связывание синтетического ДНКдуплекса HSE с дрожжевыми белками из лизатов клеток, которые различались уровнем экспрессии гена SFL1. Всего было изучено 3 штамма дрожжей: контрольный штамм 5VH19, этот же штамм с делецией гена SFL1, либо с многокопийной плазмидой, несущей ген SFL1. Оказалось, что Sfl1 связывается с элементом HSE (Рис.1), причем как в очищенном виде, так и в лизате (поскольку эффективность связывания дуплекса с белками трех лизатов зависела от уровня экспрессии SFL1) и, более того, позитивно регулирует экспрессию с этого элемента (см. Табл. 2).

Связывание промоторной последовательности HSE Сверхэкспрессия гена RPP0 приводит к накоплению белка Rpp0 во внерибосомных комплексах.

Идентифицированный нами белок Rpp0 входит в группу кислых рибосомных белков, образующих на большой субъединице рибосомы структуру, называемую "stalk", т.е. стержень. Биологическая роль этой структуры до конца не ясна, однако известно, что отсутствие кислых рибосомных белков на рибосоме приводит к изменению профиля экспрессии синтезируемых белков, при этом спектр синтезируемых белков сдвигается в сторону белков, характерных для стационарной фазы роста (Remacha et al., 1995).

Внутриклеточный избыток Rpp0 вероятнее всего не приводит к образованию рибосом с двумя копиями этого белка. Наиболее вероятным кажется образование этим белком альтернативных (внерибосомных) комплексов, которые, однако, вполне могут содержать другие кислые рибосомные белки, взаимодействующие с Rpp0, что будет приводить к их недостатку в рибосоме и, соответственно, изменению профиля синтезируемых белков (возможно, шаперонов). Для обнаружения этих комплексов мы предприняли фракционирование лизатов клеток, несущих многокопийную плазмиду с RPP0, при помощи ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы 7%-40% ( об/мин в течение 6 часов). После окончания процедуры были отобраны 14 фракций по всей длине градиента, и в каждой фракции было определено содержание Rpp0 при помощи иммуноблоттинга с использованием соответствующих антител (Рис. 2А). После этого мы оценили содержание 23S рРНК (и, следовательно, рибосом) в каждой из этих фракций с помощью агарозного электрофореза с бромистым этидием (Рис. 2Б). Оказалось, что избыток Rpp0 обнаруживается, в основном, во внерибосомных фракциях (с 3 по 7), что может объяснять биологические эффекты, возникающие при его сверхэкспрессии.

Таким образом, избыточный Rpp0 способен к образованию комплексов, которые могут каким-либо образом приводить к изменению экспрессии шаперонов и потере прионного детерминанта. Указанием на это служат данные Таблицы 2, из которых следует, что сверхэкспрессия RPP0 повышает уровень транскрипции генов SUP35 и SSA4, а также, вероятно, других генов, промоторы которых содержат последовательность HSE.

сверхэкспрессия Рис. 2 А. Сверхэкспрессированный Rpp0 накапливается во внерибосомных фракциях.

Центрифугирование в градиенте сахарозы контрольного лизата [psi-ps] и лизата клеток, несущих многокопийную плазмиду с RPP0. В отобранных фракциях определяли содержание Rpp0 при помощи иммуноблоттинга.Уровень Rpp0 возрастает по сравнению с контролем во внерибосомных фракциях 2-7. Б. Определение фракций, содержащих рибосомы. Те же фракции были разделены на агарозном геле и окрашены бромистым этидием. 23 S рРНК и 18 S рРНК представлены, начиная с 8 фракции и выше, то есть фракции 2-7 не содержат рибосом.

Разработка электрофоретического метода анализа прионных агрегатов (SDD-AGE).

Согласно литературным данным, прионное состояние белка Sup35 (проявляющееся как цитоплазматически-наследуемый детерминант [PSI+]) характеризуется накоплением в дрожжевой клетке крупных агрегатов этого белка, в то время как в неприонном состоянии Sup35 находится в растворимом виде. Существующие молекулярно-биологические ультрацентрифугирование и визуализацию агрегатов в клетках при помощи зеленого флуоресцентного белка (GFP). Эти методы не дают достаточной информации о структуре прионных агрегатов in vivo. Для того чтобы оценить размер и структуру прионных агрегатов, необходимо было найти условия, при которых разрушались бы все макромолекулярные комплексы, кроме прионных, и не разрушались бы прионные агрегаты. Мы проанализировали ряд химических соединений [мочевина, KCl, гидрохлорид гуанидина, ряд нейтральных детергентов, а также додецил сульфат натрия (SDS)] по их способности очищать прионные агрегаты. Лизат, полученный из клеток дрожжей штамма 5V-H19 [PSI+], ультрацентрифугировали при 150000g в течение 1 часа.

Полученный в этих условиях осадок содержал существенную долю прионных агрегатов Sup35 вместе с другими клеточными комплексами (включая рибосомы и пр.). Этот осадок был растворен в буфере, содержащем вышеперечисленные вещества; после чего такое же ультрацентрифугирование проводили еще раз. Содержание в осадке белка Sup определяли окрашиванием Кумасси голубым (подтверждали иммуноблоттингом). Мы отбирали вещества, дающие максимальную пропорцию Sup35 в осадке по отношению ко всем остальным белкам. Наилучшую степень очистки показал SDS: обработка макромолекулярных комплексов, однако, по-видимому, не разрушает прионные агрегаты (Рис. 3). Лизат клеток штамма 5V-H19 [PSI+] был ультрацентрифугирован при 150000g в течение 1 часа. Полученный осадок, содержащий агрегаты Sup35, был обработан 2% SDS при различных температурах от 20 до 100С. Эти образцы были анализированы электрофоретически при помощи SDS-PAGE с двумя отличиями: "концентрирующий" гель состоял из 1% агарозы вместо акриламида, и образцы перед нанесением не подвергались кипячению, что позволило анализировать в эксперименте агрегированную форму Sup35, которая мигрировала в "концентрирующем" геле, но задерживалась на старте "разделяющего" геля (Рис. 3). В образцах, обработанных SDS при температурах до 42С или меньше, мы наблюдали лишь небольшое количество мономерной формы Sup35, которая вероятно представляет фракцию Sup35, диссоциированного с рибосом. Это означает, что прионные частицы Sup35 устойчивы к SDS при этих температурах. Они начинают распадаться при 50С и почти полностью растворяются при температурах выше 70С.

Для проверки гомогенности препарата, мы анализировали электрофоретически белки, застрявшие на границе двух гелей в предыдущем эксперименте. Эти белки представляли собой фракцию SDS-устойчивых клеточных агрегатов. Мы вырезали тонкую полоску "разделяющего" геля, содержащую эти агрегаты, прокипятили ее в присутствии SDS и переложили ее поверх нового акриламидного геля. При включении электрического поля белки входили в новый гель и мигрировали в нем в соответствии со своими молекулярными массами. Единственная отчетливо детектируемая полоса в геле относится к белку Sup35 (Рис. 4), что было подтверждено иммуноокрашиванием белка Sup35. Следовательно, SDS растворяет большинство дрожжевых неприонных белковых комплексов и убирает большинство белков, ассоциированных с прионными агрегатами в дрожжевой клетке. В виду того, что каждая молекула SDS несет в себе отрицательный заряд, обработка этим веществом позволяет использовать электрофорез для дальнейшего исследования свойств прионных полимеров. Здесь и далее мы будем использовать термин "прионный полимер" для обозначения прионного вещества, полученного в результате обработки SDS, в то время как "прионные агрегаты" будут обозначать агрегаты, не обработанные SDS и находящиеся в дрожжевой клетке или в лизате дрожжей.

Рисунок 3. Полимерная форма Sup35 устойчива к действию SDS при низких температурах.

Агрегированная фракция лизата клеток штамма 5V-H19 [PSI+] была инкубирована с 2% или 5% SDS в течение 10 минут при указанных температурах и анализирована при помощи SDS-PAGE.

Иммуноокрашивание белка Sup35.

Для отделения прионных полимеров от большинства клеточных белков мы использовали электрофоретическую систему, обычно применяемую для разделения ДНК, и состоящую из буфера ТАЕ и агарозного геля. Для проверки работы метода нами были взяты лизаты клеток [PSI+] и [psi-] штамма дрожжей 5V-H19, обработанные 2% SDS в буфере ТАЕ в течение 10 минут при температуре 37°С. После обработки, лизаты были нанесены на 1,8% агарозный гель; электрофорез проводили в течение 1,5 часов при напряжении 80V. После электрофореза, белки были перенесены на мембрану, а затем окрашены антителами к Sup35 (Рис. 5). Мы показали четкое различие между образцами [PSI+] и [psi-]: в клетках [psi-] Sup35 находится в мономерной форме, тогда как в клетках [PSI+] Sup35 присутствует в агрегированной форме, т.е. в форме прионных полимеров.

Данный метод анализа прионных агрегатов мы назвали SDD-AGE (Semi-Denaturing Detergent - Agarose Gel Electrophoresis), по аналогии с SDS-PAGE.

[psi-] [PSI+] Прионные агрегаты [PSI+] состоят из полимеров белка Sup35.

Для того чтобы сопоставить размер полимеров белка Sup35 с размером его агрегатов, наблюдаемых при фракционировании в неденатурирующих условиях мы провели ультрацентрифугирование лизата клеток дрожжей штамма 5V-H19 [PSI+] в присутствии 2% SDS и в его отсутствие. Сравнение профилей центрифугирования по содержанию белка Sup35 (Рис. 6А) показало, что обработка SDS существенно уменьшает размер прионных комплексов. В среднем, масса прионных агрегатов Sup35 была примерно в раз меньше, чем масса прионных полимеров этого белка. Столь значительная разница в размерах может быть обусловлена двумя причинами: ассоциацией полимеров Sup35 с агрегатами других белков и макромолекулярными структурами (такими как рибосомы), а также тем, что в одном агрегате может находиться несколько полимеров. Из Рисунка 6А следует, что прионные агрегаты Sup35 существенно различаются по размеру. Наименьшие среди них сравнимы с прионными полимерами, наибольшие превосходят их более чем в 100 раз. Для того чтобы оценить, насколько различаются прионные полимеры, составляющие эти агрегаты, фракции, отобранные после ультрацентрифугирования, проведенного в отсутствие SDS, были проанализированы при помощи SDD-AGE (Рис.6Б).

Средний размер полимеров Sup35 из "верхних" фракций равнялся приблизительно кДа, а "нижних" фракций - примерно 1500 кДа, что составляет разницу в 1,7 раза (для агрегатов разница в размерах составила порядка 100 раз). Таким образом, можно заключить, что все прионные агрегаты состоят из полимеров примерно одинакового небольшого размера, однако более тяжелые агрегаты содержат соответственно чуть более тяжелые полимеры. Этот факт можно объяснить, предположив, что полимеры взаимодействуют друг с другом при помощи бокового слипания, образуя при этом агрегат. При этом сила взаимодействия коррелирует с площадью соприкасающихся поверхностей, то есть более крупные полимеры лучше взаимодействуют друг с другом, их среднее количество в одном агрегате больше. Поэтому даже небольшая разница в размере полимеров может приводить в большой разнице в размере агрегатов.

Рисунок 6. (А) SDS разбирает прионные агрегаты Sup35 до SDS-устойчивых частиц.

были фракционированы при помощи ультрацентрифугирования при 170 000g в отсутствие (-) или в присутствии (+) SDS.

Фракции были анализированы при помощи SDSPAGE. (Б) Отобранные после центрифугирования методом SDD-AGE. Иммуноокрашивание белка ции: 1-3 4-6 7-10 осадок Sup35.

Различным штаммам детерминантов [PSI+] и [PSI+PS] соответствует прионные полимеры разного размера.

Штаммы прионных детерминантов [PSI+] и [PSI+PS] различаются генетически по силе нонсенс-супрессорного фенотипа. Общепринятой считается гипотеза о том, что штаммовое разнообразие прионов основано на разнице в конформации прионного белка и, соответственно, в структуре прионных агрегатов. Для проверки этого предположения мы сравнили размер полимеров Sup35 в клетках с несколькими разными штаммами [PSI+] и [PSI+PS] (Рис. 7), и нашли существенную разницу в размерах. При этом оказалось, что размер прионных полимеров обратно коррелирует с силой [PSI+], а именно, "сильным" штаммам [PSI+], как правило, соответствуют меньшие полимеры, чем "слабым".

штамм Уменьшение количества Hsp104 приводит к увеличению размера прионных полимеров.

Согласно литературным данным, делеция гена шаперона Hsp104 элиминирует все известные дрожжевые прионы, в том числе и [PSI+]. Для выяснения механизмов этого явления мы попытались установить, каким образом уменьшение экспрессии Hsp влияет на размер прионных полимеров. Для постепенного уменьшения экспрессии мы заменили в геноме дрожжей промотор гена HSP104 на регулируемый тетрациклином TET промотор. Это позволило ингибировать синтез Hsp104 путем добавления антибиотика доксициклина (аналог тетрациклина) в культуральную среду. В отсутствие антибиотика происходит индукция TET промотора, а в его присутствии (5 мкг/мл) - репрессия промотора, которая приводит к медленному уменьшению уровня белка Hsp104, поскольку этот шаперон деградирует очень медленно и его количество уменьшается только в результате разведения в клеточных делениях. Клетки дрожжей штамма 5V-H19 [PSI+] росли в жидкой среде в присутствии доксициклина в течение 6 клеточных поколений, при этом после каждого удвоения плотности культуры часть клеток отбирали для дальнейшего анализа методом SDD-AGE, так что плотность культуры оставалась на примерно постоянном уровне. Было обнаружено, что размер прионных полимеров Sup начал возрастать через два клеточных поколения от момента добавления в среду антибиотика; через 6 поколений размер полимеров увеличился в 4 раза (Рис. 8А). При этом частичную потерю [PSI+] наблюдали уже после пятого деления (не показано). Потеря [PSI+] была обусловлена увеличенным размером прионных полимеров. Полученные данные свидетельствуют о том, что Hsp104 является белком, фрагментирующим прионные полимеры, и таким образом осуществляющим наследование Значительное уменьшение уровня этого белка приводит к прекращению фрагментации полимеров, что сопровождается их ростом и уменьшением их количества.

Добавление к растущим клеткам дрожжей GuHCl полностью блокирует репликацию прионного детерминанта.

GuHCl является единственным на сегодняшний день низкомолекулярным веществом, эффективно элиминирующим все известные дрожжевые прионы. Согласно имеющимся в литературе данным, GuHCl влияет на поддержание прионов, инактивируя Hsp104. Это позволяет предположить, что добавление GuHCl в культуральную среду должно приводить к росту прионных полимеров Sup35. Штамм дрожжей 5V-H19 [PSI+] был выращен в течение нескольких клеточных поколений в жидкой среде, содержащей мМ GuHCl, при этом после каждого удвоения плотности культуры часть клеток отбирали для анализа методом SDD-AGE, как и в предыдущем эксперименте. Было обнаружено, что в присутствие GuHCl средний размер полимеров Sup35 возрастал в 2 раза за одно клеточное деление (Рис. 8Б), что соответствует теоретическому максимуму роста, достигаемому в условиях, когда все мономеры Sup35 включаются в полимеры, которые в свою очередь не подвергаются фрагментации. Действительно, в этом случае общее количество прионных полимеров Sup35 на клетку остается постоянным, а число клеток за поколение удваивается, и, следовательно, число прионных полимеров Sup35 в среднем на клетку уменьшается вдвое. Так как количество Sup35 в клетках остается постоянным, и этот белок находится преимущественно в полимерной форме, количество молекул Sup35 в одном полимере должно возрасти вдвое. Таким образом, подобный рост полимеров возможен только в условиях полного блокирования их фрагментации. После удаления GuHCl из среды размер прионных полимеров возвращается к своей обычной величине (не показано).

Избыток шаперона Sis1 приводит к уменьшению размера прионных полимеров.

Проведенный в работе поиск антиприонных факторов выявил несколько белков, способных элиминировать [PSI+PS] №1. Для выявления молекулярных механизмов действия этих факторов мы воспользовались методом SDD-AGE. Разработанный метод позволяет отслеживать только сильные воздействия на структуру полимеров, приводящие к существенному изменению их размера. Сильным антиприонным действием на [PSI+PS]№1 обладал шаперон Sis1 (см. Табл. 1). Как оказалось, сверхэкспрессия гена SIS приводит к уменьшению размера прионных полимеров (Рис. 8В). Можно предположить, что шапероны семейства Hsp40, к которому относится белок Sis1, ингибируют процесс прионного перехода, стабилизируя неприонную (функциональную) конформацию мономеров Sup35-PS и замедляя, таким образом, процесс полимеризации. Это приводит к уменьшению среднего размера прионных полимеров и некоторому накоплению в клетке функционального Sup35-PS, что часто выражается в отсутствие супрессорного эффекта, вызываемого прионным детерминантом.

Разработка метода препаративного выделения прионных полимеров. Анализ структуры полимеров методом электронной микроскопии.

Для исследования тонкой структуры прионных полимеров мы разработали метод препаративного выделения полимеров, основанный на их устойчивости к действию 2% SDS при 37С. Этот детергент разрушает практически все белковые комплексы в дрожжевых клетках, поэтому большинство белков после обработки SDS присутствуют в растворе в виде мономеров. В то же время, прионные полимеры устойчивы к SDS и имеют достаточно большой молекулярный вес (более 0,5 МДа), что позволяет эффективно отделять их от белковых мономеров при помощи процедуры ультрацентрифугирования (Рис. 9). Лизат клеток [PSI+] ультрацентрифугировали (42000 об/мин, 1 час) через "столбик" 30% сахарозы, после чего отбирали фракцию осадка, содержащую помимо прионных агрегатов множество других клеточных комплексов и высокомолекулярных соединений (полирибосомы, нуклеиновые кислоты и другие соединения). Осадок интенсивно растворяли в 2-3% SDS при температуре 40С; полученный раствор повторно ультрацентрифугировали уже более долгое время (42000 об/мин, 5-12 часов в зависимости от объема раствора), после чего опять отбирали фракцию осадка (Рис. 9). На этом этапе осадок уже практически не содержал иных белков, кроме Sup35 (данные не приведены).

Процедуру очистки при необходимости повторяли несколько раз и обычно завершали диализом материала против воды или разбавленного буферного раствора для устранения остатков сахарозы и детергента; полученный препарат состоял преимущественно из белка Sup35 в форме полимеров. Далее в работе был проведен первичный электронномикроскопический анализ очищенных дрожжевых полимеров Sup35 (Рис. 10). Эта работа была выполнена В.Я. Стельмащуком и Н.А. Киселевым в Институте Кристаллографии РАН. Наблюдаемые на рисунках фибриллярные структуры состоят из Sup35, так как контрольный препарат, очищенный из [psi-] клеток, не содержит этих структур, кроме того, чистоту препарата подтверждали электрофоретически. Полученные снимки являются первыми фотографиями прионных агрегатов, очищенных из дрожжевых клеток.

Полученная информация подтверждает фибриллярную (амилоидную) природу прионных агрегатов; их более тонкие структурные характеристики требуют дальнейшего изучения.

Рис. 8. SDD-AGE анализ полимеров Sup35. Иммуноокрашивание белка Sup35.

(А) Влияние ингибирования транскрипции HSP104 (при добавлении доксициклина) на размер прионных полимеров Sup35 (описание в тексте). Цифрами указан уровень белка Hsp104, определенный относительно штамма 5V-H19 при помощи SDS-PAGE анализа и иммуноокрашивания белка Hsp104. (Б) 5V-H19 [PSI+] клетки были выращены в течение поколений в присутствии 3 мМ GuHCl. Цифрами указан средний размер прионных полимеров Sup35, нормированный на первую точку. (В) Сверхэкспрессия шаперона Sis1 приводит к уменьшению размера прионных полимеров Sup35-PS в штамме PS-5V-H19 [PSI+PS]№1 (Кконтроль, Sis - сверхэкспресия Sis1).

ДИАЛИЗ, МИКРОСКОПИЯ

Рисунок 9. Схема очистки прионных полимеров Sup35 из штамма 5V-H19 [PSI+].

Рис.10. Фотографии очищенных полимеров Sup35, выделенных из штамма 5V-H19 [PSI+]. Изображения получены при помощи электронного микроскопа В.Я. Стельмащуком и Н.А. Киселевым (Институт Кристаллографии РАН). Черный прямоугольник в углу каждой фотографии соответствует 30 нм.

ВЫВОДЫ

(1) Сверхэкспрессия шаперонов из семейств Hsp70 и Hsp40, а также транскрипционных факторов Ssn8 и Sfl1 и рибосомного белка Rpp0 элиминирует прионный детерминант [PSI+PS].

(2) Белки Ssn8, Sfl1 и Rpp0 регулируют экспрессию шаперонов, при этом Sfl1 связывается с последовательностью HSE, характерной для промоторов генов шаперонов, и активирует транскрипцию, опосредованную этим элементом. Такая регуляция может объяснять антиприонные эффекты сверхэкспрессии этих белков.

(3) Разработаны новые методы выделения прионных частиц и оценки их размера, основанные на устойчивости этих частиц к додецил сульфату натрия. Показано, что прионные частицы [PSI+] имеют сложную структурную организацию, представляя собой агрегаты небольших полимеров белка Sup35.

(4) Штаммы прионного детерминанта [PSI+] различаются друг от друга по размеру полимеров.

(5) Сверхэкспрессия шаперона Sis1 приводит к уменьшению размера прионных полимеров Sup35, в то время как снижение активности шаперона Hsp104, напротив, приводит к увеличению их размера. На основании этих результатов высказаны гипотезы об участии этих шаперонов в поддержании детерминанта [PSI+] в клетках дрожжей.

1) V.V. Kushnirov, D.S. Kryndushkin, M. Boguta, V.N. Smirnov and M.D. Ter-Avanesyan Chaperones that cure yeast artificial [PSI+] and their prion-specific effects Current Biology, 2000, 10:22:1443-1446.

2) D.S. Kryndushkin, V.N. Smirnov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov Increased expression of Hsp40 chaperones, transcriptional factors and ribosomal protein Rpp0 can cure yeast prions J Biol Chem, 2002, Jun 28; 277(26): 23702-8.

3) D.S. Kryndushkin, I. Alexandrov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov Yeast [PSI+] Prion Aggregates Are Formed by Small Sup35 Polymers Fragmented by Hsp J Biol Chem, 2003, Dec 5; 278(49): 49636-43.

4) Крындушкин Д, Кушниров В. Клонирование и характеризация дрожжевых генов, вызывающих изгнание прионного состояния белка Sup35 XLIII Научная Конференция МФТИ, Секция VI, стр. 17, Москва, 2000.

5) Kushnirov VV, Kryndushkin DS, Boguta M, Ter-Avanesyan MD Novel chaperones that cure yeast prions International symposium on prion diseases and related processes, p. 113, Anneсy, France, 2000.

6) D.S. Kryndushkin, V.V. Kushnirov, Michael D. Ter-Avanesyan A screen for yeast prion-curing factors XXth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. Prague, 2001.

Опубликовано: Yeast, 2001, Vol.18, No.S1, p.S31.

7) Д.С. Крындушкин, И.М. Александров, М.Д. Тер-Аванесян, В.В. Кушниров.

Новый метод анализа структуры прионных агрегатов в дрожжах Saccaromyces cerevisiae III Конгресс Российского Биохимического Общества, Симпозиум XI, стр.

496, Санкт-Петербург, Россия, 2002.

8). Kushnirov VV, Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesjan MD.

Sup35 prion aggregates are composed of small sup35 oligomers fragmented by hsp 2nd International Yeast Prion Meeting, p.43, Calistoga, CA, USA, 2002.

9) D.S. Kryndushkin, I.M. Alexandrov, V.V. Kushnirov and M.D. Ter-Avanesyan Two-level structure of the [PSI+] prion particles XXIst International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, Gothenburg, Sweden, 2003. Опубликовано: Yeast, 2003; Vol.20, No.S1, p.S390.



Похожие работы:

«КОЧЕТОВА Галина Владимировна УЧАСТИЕ ФИТОХРОМОВ А И В В РЕГУЛЯЦИИ УСТЬИЧНЫХ ДВИЖЕНИЙ У Pisum sativum L. Специальность 03.00.12 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва, 2008 Диссертационная работа выполнена на кафедре физиологии растений биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова. Научные руководители: кандидат биологический наук Баштанова Ульяна...»

«КАЛИМУЛЛИН Радик Рифкатович МЕТОДИКА МОДЕЛИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ДВУХФАЗНОЙ ЖИДКОСТИ В ВИХРЕВОМ ТЕПЛОГЕНЕРАТОРЕ Специальность 05.04.13 – Гидравлические машины и гидропневмоагрегаты АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Уфа – 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет на кафедре прикладной гидромеханики Научный руководитель : доктор технических наук, профессор ЦЕЛИЩЕВ Владимир Александрович,...»

«Десятова Олеся Александровна АГАРИКОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.00.24 – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научный руководитель доктор биологических наук,...»

«КАРИЦКАЯ ЛАДА ЮРЬЕВНА ЭКСПРЕССИВНЫЕ РЕСУРСЫ СОВРЕМЕННОЙ ГАЗЕТНОЙ ПУБЛИЦИСТИКИ (на материале газет Мурманского региона 2001-2012 гг.) Специальность 10.02.01 – русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Архангельск 2013 Работа выполнена на кафедре русской филологии ФГБОУ ВПО Мурманский государственный гуманитарный университет Научные доктор филологических наук, профессор кафедры русского языка, руководители: литературы и...»

«ПАНКРАТОВ Сергей Александрович МОДЕЛИРОВАНИЕ ДЕФОРМАЦИОННЫХ ДИНАМИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЗАДАЧАХ СЕЙСМОРАЗВЕДКИ Специальность 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физикоматематических наук МОСКВА – 2012 Работа выполнена на кафедре информатики Московского физико-технического института (государственного университета) Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор...»

«Ганеев Тимур Ирекович ВЛИЯНИЕ МЕХАНОАКТИВИРОВАННОЙ АМОРФНОЙ КАЛЬЦИЕВОЙ СОЛИ ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЁ КОМБИНАЦИИ С АНТИОКСИДАНТНЫМ ПРЕПАРАТОМ НА ОБМЕН КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ДИХЛОРЭТАНОМ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 03.01.04 – Биохимия 14.03.03 — Патологическая физиология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень — 2012 Работа выполнена на кафедре биологической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения...»

«Железов Роман Владимирович РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННОСПРАВОЧНОЙ СИСТЕМЫ ПОИСКА ОПТИМАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРОЕЗДА НА ПАССАЖИРСКОМ ТРАНСПОРТЕ Специальность 05.12.13 – Системы, сети и устройства телекоммуникаций. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре телекоммуникационных сетей и систем в Московском физико-техническом институте (государственном университете). Научный руководитель : доктор...»

«УДК 008.001. Дегтярёва Ольга Александровна ЗЕРКАЛО КАК ОБЩЕКУЛЬТУРНЫЙ ФЕНОМЕН Специальность: 24.00.01 - теория и история культуры АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата культурологии Санкт- Петербург 2002г. 2 Работа выполнена на кафедре философии и культурологии Республиканского Гуманитарного института при СанктПетербургском государственном университете Научный руководитель : кандидат философских наук, доцент Т.В.Холостова Официальные оппоненты :...»

«НЕФЕДОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ЖИВОТНЫХ К АНТРОПОГЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ (НА ПРИМЕРЕ РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология 0З.03.01 – физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск - 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук, профессор Иванов Евгений...»

«ДОНЧЕНКО Сергей Сергеевич ПОЭТИЧЕСКАЯ ТРАДИЦИЯ НАРОДНЫХ ПЕВЦОВ БЕНГАЛИИ: ТВОРЧЕСТВО БАУЛОВ Специальность 10.01.03 – литература народов стран зарубежья (литературы стран Азии и Африки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена на кафедре индийской филологии Восточного факультета Санкт-Петербургского государственного университета. Научный руководитель...»

«ЧЕРНЯК Кирилл Григорьевич ОРИЕНТАЦИЯ И СТРУКТУРА СЕГНЕТОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СМЕКТИКОВ С* ВО ВНЕШНЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ Специальность 01.04.02 теоретическая физика Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Санкт-Петербург 2010 год Работа выполнена на кафедре статистической физики физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор...»

«Карпухина Наталья Валерьевна ГЕОМОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ И ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ РЕЛЬЕФА ЧУДСКО-ПСКОВСКОЙ НИЗМЕННОСТИ 25.00.25 – геоморфология и эволюционная география Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата географических наук Москва 2013 Работа выполнена на кафедре геоморфологии и палеогеографии географического факультета федерального бюджетного образовательного учреждения...»

«ФРОЛОВ Даниил Анатольевич ФЛОРА БАССЕЙНА РЕКИ СВИЯГИ 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей Викторович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мартыненко Вера Антоновна...»

«УДК616.345:(616.33+616.329)-002.44(615.32+615.37) Черёмушкина Наталья Васильевна Особенности метаболизма оксида азота при гастроэзофагеальной рефлюксной болезни 14.00.05 - Внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО Московский государственный медикостоматологический университет Росздрава Научный руководитель : доктор медицинских наук, Маев Игорь Вениаминович профессор Официальные...»

«КОНОВАЛОВ ВАЛЕРИЙ НИКОЛАЕВИЧ ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХВОЙНЫХ НА ОСУШАЕМЫХ И УДОБРЯЕМЫХ ПОЧВАХ 06.03.02.– Лесоведение, лесоводство, лесоустройство и лесная таксация АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора сельскохозяйственных наук Архангельск – 2011 2 Работа выполнена в ФГ АОУ ВПО Северный (Арктический) федеральный университет имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Феклистов Павел Александрович...»

«Красилов Артем Николаевич Анализ эффективности гибридного доступа к каналу в многошаговых беспроводных сетях 05.12.13 – Системы, сети и устройства телекоммуникаций АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем передачи информации им. А.А. Харкевича Российской академии наук (ИППИ РАН). доктор технических наук, Научный руководитель : старший...»

«Чащин Владимир Владимирович ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ МАРКЕТИНГА ПЕРСОНАЛА НА РЫНКЕ ТРУДА Специальность 08.00.05 – экономика и управление народным хозяйством: маркетинг АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора экономических наук Ростов-на-Дону – 2013 Работа выполнена на кафедре Маркетинг и реклама в ФГБОУ Волгоградском государственном университете. Научный консультант : Попкова Елена Геннадьевна доктор экономических наук, профессор ФГБОУ ВПО Волгоградский...»

«КРАВЧЕНКО Олег Александрович ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА СОЗДАНИЯ ЭЛЕКТРОМЕХАНИЧЕСКИХ СИЛОКОМПЕНСИРУЮЩИХ СИСТЕМ ТРЕНАЖЁРОВ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ КОСМОНАВТОВ Специальность 05.09.03 – Электротехнические комплексы и системы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора технических наук Новочеркасск – 2013 г. 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования ЮжноРоссийский государственный технический...»

«Гребенкина Татьяна Михайловна МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА PLANTAGO L. В СВЯЗИ С УСЛОВИЯМИ ПРОИЗРАСТАНИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт экологии Волжского бассейна Российской академии наук Научный руководитель : Розенцвет Ольга...»

«ГАСИЧ Екатерина Юрьевна ФЕНОМЕН СТИЛЯ В ОТЕЧЕСТВЕННОМ МУЗЫКОЗНАНИИ: ИСТОРИЧЕСКИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ НАУЧНЫХ КОНЦЕПЦИЙ Специальность 17.00.02 – музыкальное искусство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Ростов-на-Дону 2012 Работа выполнена на кафедре теории музыки и композиции Ростовской государственной консерватории (академии) им. С.В. Рахманинова кандидат искусствоведения, профессор Научный руководитель : Тараева Галина Рубеновна доктор...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.