На правах рукописи
МИЧУРИНА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА
ИНТЕНСИФИКАЦИЯ БИОСИНТЕЗА ЭРИТРОМИЦИНА А
ФАКТОРАМИ, СНИЖАЮЩИМИ ЛИЗИС В КУЛЬТУРЕ
SACCHAROPOLYSPORA ERYTHRAEA
03.00.23. - Биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2007
Работа выполнена на кафедре Экологической и промышленной биотехнологии в Московском государственном университете инженерной экологии.
Научный руководитель: кандидат биологических наук Сергеева Алла Владимировна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Бибикова Маргарита Васильевна доктор биологических наук, профессор Воробьева Лена Ивановна
Ведущая организация: Научно-Исследовательский Институт по изысканию новых антибиотиков Российской Академии Медицинских Наук им. Г.Ф.Гаузе
Защита состоится 22 мая 2007 года в _ на заседании диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д.9) в ауд. 443.
С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.
Автореферат диссертации разослан «» _ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета ДМ 212.204.13 Шакир И.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы В настоящее время Россия значительно отстает от мировых темпов развития биотехнологии. Производство антибиотиков в нашей стране на основе микробного синтеза стало нерентабельным. Однако фармсубстанции таких антибиотиков, как бензилпенициллин, окситетрациклин, канамицин и эритромицин, имеют высокий спрос на внутреннем рынке, поскольку они с успехом используются для изготовления на их основе лекарственных средств и для трансформации в еще более эффективные полусинтетические антибиотики.
Практическая ценность производных эритромицина стимулировала интерес к новым модификациям молекулы антибиотика. Исходным сырьем служит субстанция эритромицина, получаемая в результате глубинного культивирования штаммов Saccharopolyspora erythraea, с последующим выделением и очисткой. Перспективный рынок сбыта имеют преимущественно быстрорастворимые препараты, содержащие свыше 90% эритромицина А.
Поэтому актуальным является повышение эффективности промышленного производства эритромицина А, которое связано с созданием новых высокопродуктивных штаммов-продуцентов и усовершенствованием технологии биосинтеза.
Цель работы – повышение продукции эритромицина А штаммом S. erythraea С-77 за счет снижения интенсивности процессов лизиса мицелия при глубинном культивировании.
Основные задачи - разработать метод оценки состояния культуры при глубинном культивировании на комплексной среде;
- на основе высокопродуктивного штамма S. erythraea С-77 получить мутантный штамм с повышенной устойчивостью мицелия к лизису;
- исследовать влияние антиоксидантов на лизис мицелия в глубинной культуре;
- оценить влияние компонентов питательной среды на литические процессы в культуре S. erythraea С-77;
- наметить пути предотвращения лизиса культуры и воздействия на нее неблагоприятных факторов, снижающих биосинтез эритромицинов;
- оптимизировать составы посевной и ферментационной сред с целью повышения выхода эритромицина А.
Научная новизна - Разработана оригинальная методика оценки степени лизиса мицелия при ферментационной среде по концентрации ДНК в нативной жидкости (супернатанте).
характеризующийся повышенной устойчивостью мицелия к лизису.
- Показано, что одной из причин лизиса мицелия продуцента эритромицина в глубинной культуре является негативное воздействие окислительного стресса.
Впервые показано положительное влияние антиоксидантов (цитохром С, бутилоксианизол, -токоферол) на рост мицелия S. erythraea и биосинтез эритромицинов.
- Физиологически обосновано повышение продукции эритромицинов на средах с преимущественным содержанием липидов в качестве основного источника углерода.
- Предложен подход к оптимизации ферментационной среды, основанный на сбалансированности основных источников углерода (углеводов и липидов).
Разработана и экспериментально проверена среда, обеспечивающая повышение продукции эритромицина А на 40-50 %.
Практическая значимость - Предложено использовать концентрацию ДНК в нативной жидкости для оценки лизиса мицелия актиномицетов при глубинном культивировании на комплексных средах. Этот параметр позволил достоверно оценивать состояние глубинной культуры S. erythraea при ферментации.
- Получен мутантный штамм S. erythraea TunR-2, характеризующийся повышенной устойчивостью клеточной стенки к механическому воздействию мешалок при культивировании в биореакторах.
- Разработаны новые посевная и ферментационная среды, позволяющие снизить затраты на компоненты сырья в два раза и увеличить продукцию эритромицина А на 40-50%.
- Разработан лабораторный регламент оптимизированной технологии биосинтеза эритромицина, использованный ООО ПКФ «БИГОР» при подготовке исходных данных для проектирования производства эритромицинаоснования.
- Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология конкурентноспособного производства эритромицина А в России.
Апробация работы Результаты диссертационной работы докладывались:
на 8 и 9-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых: Биотехнология – наука XXI века, Пущино, 2004, 2005 гг.; на Всероссийской выставке научнотехнического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2005 г.; на 19-ой Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, 2005 г.
Публикации По теме диссертации опубликован 1 патент и 9 печатных работ, из них 2 – статьи в реферируемом журнале, 2 – статьи в сборниках научных трудов РХТУ им. Д.И. Менделеева и МГУИЭ, 5 – тезисы научных конференций.
Структура и объем работы Диссертационная работа включает:
введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Диссертация изложена на 159 страницах текста, содержит таблиц и 34 рисунка; список литературы включает 240 наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов, указан личный вклад соискателя.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
В обзоре литературы рассмотрены основные свойства антибиотика эритромицина А и его синтетических производных. Описан биогенез молекулы эритромицина А, физиологическая и биохимическая регуляция его биосинтеза.Показана взаимосвязь морфологических изменений и биосинтеза эритромицинов в культурах актиномицетов, в том числе S. erythraea.
Обобщены и проанализированы работы, в которых показана связь окислительного стресса с литическими процессами. Рассмотрены особенности метаболизма актиномицетов на средах с углеводами и липидами и возможные механизмы защиты мицелия от лизиса. Обобщены патентные данные о производстве субстанции эритромицина в России и за рубежом.
Анализ литературных данных позволил сформулировать задачи данного исследования.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектом исследования являлись штаммы Saccharopolyspora erythraea:высокопродуктивный С-77 (Патент 2281332 РФ, 2004) и полученные на его основе мутанты. Глубинное культивирование проводили на качалочных колбах объемом 250 мл (25 мл среды) и 750 мл (40 мл среды) на ротационных качалках (220-300 об/мин) и в лабораторных ферментерах «Анкум», объемом 10 л (мешалки турбинного типа, 800-1000 об/мин, расход воздуха 4-6 л/мин.) при температуре 33±1°С. Содержание биомассы определяли гравиметрически («по сухому весу»), объемным методом: 10 мл культуральной жидкости центрифугировали при 4000 об/мин 10 мин и учитывали объем, занимаемый влажной биомассой в процентах от общего объема («по влажной биомассе») и по концентрации ДНК в биомассе (определяли модифицированным методом Бартона (Burton K., 1968)). Количественное определение антибиотиков эритромицинового комплекса и углеводов проводили методом ТСХ (Kibwage I.O., 1988) в сочетании с оптической денситометрией на приборе High speed TLC scanner CS-920 фирмы Shimadzu. Обработку экспериментальных данных сукцинатдегидрогеназы определяли колориметрически по восстановлению трифенилтеразолия (Гривинь П.П., 1968). Оптимизацию питательной среды проводили с использованием метода Бокса-Уилсона. Для статистической оценки результатов использовали расчет дисперсии воспроизводимости относительного отклонения величины, усредненный по большому массиву экспериментов, расчет доверительных интервалов средних значений и разницы двух значений (Бирюков В.В., 2004).
2.2.1. Характеристика развития культуры S. erythraea на основании анализа степени лизиса мицелия при глубинной ферментации концентрация ДНК в биомассе, мг/л; мг ДНК/г БМ – количество мг ДНКБМ в 1г БМ; ДНКНЖ– концентбиомассе (ДНКБМ), а рация ДНК в нативной жидкости, мг/л на комплексной среде в биореакторе. Вл. БМ – цированный с учетом концентрация биомассы «по влажной биомассе»,%; особенностей Er A– концентрация эритромицина А, г/л культуральной жидкости (КЖ) S. erythraea С-77.
На модельной среде, не содержащей твердых частиц, в качалочных колбах провели анализ биомассы по двум параметрам: по «сухому весу» и по концентрации ДНК. В результате выяснилось, что временной профиль содержания ДНК в биомассе более соответствует классической кривой роста, чем временной профиль, измеренный по «сухому весу» биомассы (рис.1). Фаза лизиса мицелия (после 96 часов) хорошо согласовалась с нарастанием содержания ДНКНЖ. На комплексной ферментационной среде Ф в лабораторных биореакторах установлена также корреляция концентрации ДНКБМ и «влажной биомассы» (вл. БМ) (рис. 2). Лизис в культуре проявлялся уже в ростовой фазе, основная продукция антибиотика эритромицина А (Er A) происходила в условиях лизиса значительной части мицелия.
В дальнейшем для характеристики ростовых процессов культуры использовали такие показатели как «влажная биомасса» и концентрация ДНК в биомассе – для определения количества биомассы, содержание ДНК в нативной жидкости – для оценки лизиса мицелия в процессе культивирования.
2.2.2. Селекция мутантов, устойчивых к антибиотикам – ингибиторам % к контролю Количество продуктивных колоний в популяции Er A целью повышения Рис. 3. Уровень продукции эритромицина А продукции эритромицинов у мутантов, устойчивых к антибиотикам. и стабилизации этого (% к контролю – показателям штамма С-77).
признака дополнительно провели селекцию полученных мутантов на устойчивость к хлорамфениколу (CmR, 7 мкг/мл). Для дальнейшей работы были выбраны мутанты TunR, устойчивые к 25 мкг/мл туникамицина, так как они показали наибольшее увеличение продукции антибиотика (10-17%) при культивировании в колбах и самую высокую стабильность сохранения этого признака в поколениях (рис. 3).
% к контролю Рис. 4. Основные усредненные показатели устойчивости мицелия к механическому четырех ферментаций воздействию мешалок. Однако устойчивость штамма TunR-2 в биореакгиф мутанта к лизису не повлияла на торах (% к показателям ферментаций штамма С-77, 2.2.3. Влияние антиоксидантов на развитие S. erythraea С- Одним из основных факторов, повреждающих липиды мембран, являются активные формы кислорода (АФК). Они образуются в клетках, в основном, в процессе дыхания. Для выявления наличия АФК и окислительного стресса в мицелии S. erythraea C-77 как возможных факторов, воздействующих на рост и лизис культуры, исследовали влияние антиоксидантов: цитохрома С (Цит С, 30-60 мкг/мл), бутилоксианизола (БОА, 20-60 мкг/мл), бутилокситолуола (БОТ, 10-40 мкг/мл), -токоферола (ТФ, 10-20 мкг/мл). В качестве агента, усиливающего окисление липидов мембран в присутствии АФК, тестировали % к контролю ферментации S. erythraea С-77 на среде Ф.
(% к контролю без добавок, 6-е сутки).
незначительно повышался (от 2 до 11%) в присутствии всех антиоксидантов (кроме БОТ). Очевидно в условиях культивирования актиномицета на ферментационной среде Ф, обогащенной углеводами и липидами, в мицелии ощущается дефицит эндогенной антиокислительной защитной системы. На фоне этого дефицита и проявляется защитная роль экзогенных антиоксидантов.
В присутствии ионов железа наблюдали резкое снижение накопления биомассы (на 46%), повышение лизиса мицелия (на 11%) и снижение биосинтеза антибиотика (на 27%).
2.2.4. Развитие S. erythraea С-77 на «липидной» и «углеводной»
В состав ферментационной среды Ф входят два разнокачественных по характеру метаболизма углеродных субстрата: углеводы (крахмал – 30г/л, декстрин – 40г/л) и липиды (соевое масло – 50г/л). Источники образования АФК при катаболизме липидов и углеводов могут быть различными. При утилизации липидов повышается потребность в кислороде. Липиды также являются более эффективными «поставщиками» метаболитов для синтеза агликонов макролидных антибиотиков. Поэтому представляло интерес исследовать влияние одного из антиоксидантов (-токоферола) на развитие Параметры роста и биосинтеза при среде (среда ФУ, С-субкультивировании S. erythraea С- y : для ДНКБМ – ±2,9%, ДНКНЖ – ±3,2%, рует активнее. Одной из причин Er – ±5,6% ; доверительные интервалы разницы значений : для ДНКБМ – электронов на кислород, который выполняет защитную антиокислительную функцию в дополнение к супероксиддисмутазе и каталазе (Karaffa L. et. al., 1999). Наличие этого цианидрезистентного дыхания показано у S. erythraea (Scott R.I., et. al., 1989). Накопление суммарных эритромицинов (Er) в «липидной» культуре на 14% выше, а в «углеводной» – на 48% ниже, чем в контрольной на среде Ф (на 8-е сутки ферментации).
На основании представленных данных можно сделать вывод, что сдерживание антиоксидантами процессов лизиса мицелия и увеличение содержания биомассы в культуре не являются факторами, специфически влияющими на интенсивность биосинтеза эритромицинов. Т.е. для увеличения продуктивности глубинных культур S. erythraea необходимо создавать условия, при которых антиоксидантная защита предотвращала бы лизис продуктивного Добавка эритромицинового комплекса, мM (в 2-сут. культуру) (5 сутки культивирования) МЕВ ErA ErD Рис. 6. Влияние янтарной кислоты на ФУ на 5-е сутки ферментации (данные ТСХ). шественника в биосинтезе а – культура на среде Ф9 (контроль), б – на Обозначения: МЕВ – микарозилэритронолид В; ErA, ErD – эритромицины А и D.
КоА. Однако изучение влияния сукцината на биосинтез эритромицинов показало, что янтарная кислота активно вовлекается и в центральный метаболизм, в том числе в биосинтез углеводных компонентов молекулы эритромицинов (табл. 2, рис. 6). В культуре на среде ФЛ1 (содержит 50 г/л соевого масла и не содержит декстрин) сукцинат вызывал снижение накопления МЕВ (предшественник ErD с одним углеводным компонентом микарозой, присоединенной к лактону) и увеличение накопления ErD (к лактону присоединены два углеводных компонента: микароза и дезозамин).
Об активном окислении янтарной кислоты в «липидной» культуре (среда ФЛ1) свидетельствует повышенная активность сукцинатдегидрогеназы: наши исследования показали, что она в два раза выше, чем в «углеводной» культуре (среда ФУ). Эти данные свидетельствуют о необходимости наличия углеводов в среде не только как предшественников углеводных компонентов эритромицинов, но и как фактора, сдерживающего окисление янтарной кислоты и сберегающего ее для синтеза лактона.
2.2.5. Оптимизация питательных сред для штамма S. erythraea C- Исходя из вышеизложенного, представлялось целесообразным провести оптимизацию состава ферментационной среды методом математического планирования на основе изменения соотношения концентрации углеводных и липидных компонентов. Варьирование проводили по 4-м факторам; по результатам экспериментов оценили значимость коэффициентов регрессии для различных компонентов среды. В результате оптимизации из среды полностью исключен крахмал, содержание декстрина уменьшено в 1,6 раз и незначительно снижено содержание масла – на 10%. Соотношение липиды/углеводы в оптимизированной среде Ф9 увеличилось в 2,5 раза по сравнению с подобным соотношением в среде Ф. При ферментации на среде Ф9 уровень биосинтеза суммарных эритромицинов возрос на 10-12%, а эритромицина А – на 40-50%;
процентное содержание компонента эритромицина А в общей сумме эритромицинов повысилось на 20-22%.
Для среды Ф9 была подобрана посевная среда ПС-2А, не содержащая крахмал.
2.2.6. Исследование развития культур на ферментационных средах Ф и Ф Было проведено сравнительное исследование динамики накопления антибиотика и изменений ряда параметров культуральной жидкости в процессе ферментации на качалочных колбах на исходной Ф и новой Ф9 средах. В культуре на среде Ф9 синтез эритромицина А происходил с повышенной скоростью, в результате чего к 7 суткам его концентрация составила 6,6±0,3 г/л Er А, г/л; ОРВ, % Рис. 7. Накопление эритромицина А и динамика утилизации углеводов (общих редуцирующих веществ, ОРВ) при ферментации на средах Ф и Ф Липиды, % соевого масла на средах Ф и Ф эритромицина А. Улучшение ростовых характеристик в культуре на среде Ф за счет преимущественного усвоения липидов и ослабления окислительного стресса замедляет лизис продуктивного мицелия и пролонгирует образование эритромицина А в период между 144 и 192 ч. роста (рис. 7).
Таким образом, результаты наших исследований позволяют предположить, что ранняя фрагментация и лизис мицелия S. erythraea обусловлены наличием окислительного стресса под влиянием эндогенных АФК, в образование которых основной вклад вносят процессы катаболизма углеводов. Присутствие экзогенных антиоксидантов в культуре на среде Ф9, богатой углеводами, защищает рост всей массы мицелия, но не способствует значительному повышению продуктивности культуры. Более эффективным способом интенсификации биосинтеза эритромицинов оказалось изменение состава ферментационной среды в сторону значительного снижения в ней содержания углеводов. В культуре на оптимизированной среде ослабление окислительного стресса благоприятствует пролонгированию потреблению липидов.
2.2.7. Экономическая оценка применения новой технологии биосинтеза Экономическая оценка применения исходной и новой технологий биосинтеза Количество эритромицина А на 7 сутки Количество эритромицина-основания, которое может быть получено из 1 м3 КЖ при условии 4,2±0,2 6,0±0, выхода 70% на стадии выделения и очистки, кг Затраты на компоненты питательной среды для получения 1 кг эритромицина-основания, руб/кг На основе новых посевной и ферментационной питательных сред разработан лабораторный регламент на технологию биосинтеза эритромицина, использованный ООО ПКФ «БИГОР» при подготовке исходных данных для проектирования производства эритромицина-основания. Предварительный экономический расчет стадии биосинтеза (табл. 3) показал, что применение новой технологии позволит снизить затраты на компоненты питательной среды для получения 1кг эритромицина-основания в два раза.
3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Разработан метод оценки роста и лизиса мицелия при глубинном культивировании S. erythraea на комплексной среде, основанный на определении концентрации ДНК в биомассе и в нативной жидкости (супернатанте). Установлено, что лизис в культуре высокопродуктивного штамма С-77 проявляется уже в ростовой фазе, и основная продукция антибиотика происходит в условиях лизиса значительной части мицелия.2. Получены мутанты высокопродуктивного штамма С-77, устойчивые к ингибиторам синтеза клеточной стенки. Мутант TunR-2, устойчивый к туникамицину, показал стабильное повышение продукции эритромицинов на 10-17% при культивировании в колбах. При ферментации в биореакторе обнаружена повышенная устойчивость мицелия мутанта к механическому воздействию мешалок.
3. Впервые обнаружено наличие сильного окислительного стресса в растущем мицелии S. erythraea С-77 и его негативное воздействие на ростовые характеристики при ферментации в среде с высокой концентрацией углеродсодержащих субстратов. В присутствии антиоксидантов (цитохром С, -токоферол, бутилоксианизол) значительно увеличивается максимальный прирост биомассы (до 70-90%) и снижается степень лизиса мицелия (на 5-50%).
В то же время экзогенные антиоксиданты не оказывают специфического стимулирующего воздействия на биосинтез эритромицинов.
4. Обнаружено существенное снижение степени окислительного стресса в культуре, развивающейся на среде с преимущественным содержанием соевого масла, по сравнению с культурой на среде с преимущественным содержанием полисахаридов (крахмала и декстрина).
5. Показано двукратное увеличение активности сукцинатдегидрогеназы в мицелии «липидной» культуры, по сравнению с мицелием «углеводной»
культуры, и влияние янтарной кислоты на образование углеводных компонентов эритромицинов.
«