WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

на правах рукописи

УДК 533.9

МИРОНОВА ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

Фототаксис в Halobacterium salinarum:

картирование региона взаимодействия сенсорного родопсина 1 и

трансдьюсера 1 и

функциональная характеризация сенсорного родопсина 2

03.00.02. – биофизика автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена в Московском физико-техническом институте и Институте структурной биологии Исследовательского центра г. Юлиха.

Научный руководитель:

Горделий Валентин Иванович кандидат физико-математических наук

Официальные оппоненты:

Манухов Илья Владимирович кандидат биологических наук Лифшиц Михаил Аронович доктор физико-математических наук

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (г. Москва)

Защита состоится 2005 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета К 212.156.03 при Московском физико-техническом институте (141700, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер. 9, МФТИ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан «» _ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук В.Е. Брагин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы.

Последнее время всё большее внимание уделяется проблемам белокбелковых взаимодействий. Передача сигнала в клетке является одним из важных и интересных примеров таких взаимодействий. Как природа сигнала, так и механизм его передачи могут различаться, но, безусловно, имеются особенности, общие для многих организмов.

Многие важные клеточные рецепторы являются мембранными белками.

Данная работа посвящена исследованию сенсорных родопсинов 1 и 2, а также их трансдьюсеров из Halobacterium salinarum (устаревшее название – Halobacterium halobium). Сенсорные родопсины 1 и 2 являются белкамирецепторами и отвечают за фототаксис. Они представляют собой трансмембранных спиралей с относительно короткими линкерными участками и хромофором ретиналем, соединенным с белком через основание Шиффа.

Дополнительную значимость исследованию этих белков придает их структурное и функциональное сходство со зрительными пигментами животных – родопсинами.

Сенсорный родопсин 2 (СР2, часто называемый фобородопсином) ответственен за отрицательный фототаксис и синтезируется клетками в нормальных условиях, когда кислорода и питательных веществ достаточно для осуществления аэробного дыхания. При этом бактерии стремятся покинуть освещенные области во избежание возможного повреждения ДНК путем фотоокисления. Максимум поглощения СР2 приходится на максимум солнечного спектра на поверхности Земли, что позволяет H.salinarum максимально эффективно осуществлять поиск затененных областей.

В отличие от фобородопсина, который служит лишь рецепторомрепеллентом, СР1 выполняет более сложные функции – определяет положительный ответ клетки на оранжевый свет (функция рецепторааттрактанта) и отрицательный – на свет фиолетовой области (функция рецептора-репеллента). Тем самым СР1 играет важную роль в регуляции жизненного цикла бактерии: он является частью сложной системы H.salinarum, отвечающей за автотрофное питание организма в отсутствие поступления достаточного количества питательных веществ извне.

Передача сигнала с рецептора на флагеллярный мотор архебактерии осуществляется не на прямую, а через каскад киназ при помощи специального белка-трансдьюсера (Гтр), ассоциированного в мембранной части с рецептором.

Структурно галобактериальный трансдьюсер (Гтр) – это 2 трансмембранных спирали и длинный цитоплазматический домен с участками метилирования.

Гтр2 имеет интересную особенность, отличающую его от других трансдьюсеров: периплазматический домен, позволяющий ему функционировать как хеморецептору. Трансдьюсеры сенсорных родопсинов архебактерий высоко гомологичны хеморецепторам эубактерий, представляя, тем самым, особый интерес как эволюционно родственные белки.

Исследования этих рецепторов самих по себе или в комплексе с соответствующими трасдьюсерами позволят больше узнать о связи структуры и функции гомологичных белков, углубить понимание механизмов фото- и хемотаксиса, а также эволюции механизмов передачи сигнала в клетках вообще и эволюции белков-рецепторов в частности.

Цели и задачи.

СР2 – один из наименее исследованных ретинальных белков архебактерий. Хотя он был обнаружен в 1986 году, наши познания ограничены лишь некоторыми особенностями его фотофизиологии на основании спектроскопических данных. Причиной тому является его нестабильность и, следовательно, невозможность получить необходимые для исследований количества белка. Решению этой проблемы и посвящена первая часть данной работы. Было решено найти стабильную систему экспрессии в системе Escherichia coli, разработать эффективную методику очистки и более подробно охарактеризовать данный белок как в детергенте, так и в близком к нативному окружении.

Целью второй части работы было изучение природы взаимодействия между СР1 и его белком-партнером – Гтр1. Первоначальной задачей было нахождение оптимальных условий экспрессии и очистки рецептора и трансдьюсера. Затем требовалось разработать метод совместной реконструкции СР1 в липидные мембраны самого по себе и с трансдьюсером. Наконец, было необходимо прокартировать регион взаимодействия между этими белками и найти минимальный по длине цитоплазматической части, но все еще взаимодействующий с СР1 трансдьюсер.

Научная новизна.

Достигнута функциональная экспрессия СР2 из Halobacterium salinarum в клетках Escherichia coli, разработана эффективная методика его очистки и реконструкции в липидные мембраны. Это дало возможность исследовать фотохимические свойства фобородопсина в разном окружении. Впервые получен рамановский спектр СР2 в липидном окружении, дающий ценную информацию об особенностях структуры его хромофора.

Хотя методы экспрессии и очистки СР1 были опубликованы ранее, они не удовлетворяли требованиям к качеству белка и были существенно модифицированы, что повысило чистоту рекомбинантного СР1. То же относится к полноразмерному Гтр1 и его делеционным мутантам: вместо экспрессии в H.salinarum была разработана система экспрессии в E.coli и последующей очистки рекомбинантных трансдьюсеров.

Впервые проведена успешная реконструкция СР1 в мембраны полярных липидов пурпурных мебран H.salinarum, а также совместная реконструкция рецептора и делеционных мутантов трансдьюсера из отдельных очищенных компонентов. Проведено полное ступенчатое картирование цитоплазматической части Гтр1 от 147 до 52 аминокислотного остатка – завершающего вторую трансмембранную спираль в трансдьюсере – в полярных липидах пурпурных мембран H.salinarum. Проанализировано влияние делеционных мутантов трансдьюсера на фотоцикл сенсорного родопсина 1.

Кроме того, созданы химерные белки, состоящие из СР1 и Гтр1 длиной 52, 71 и 147 аминокислотных остатков, а также химерный белок, состоящий из СР1 и цитоплазматического участка Гтр1 между 53 и 147 аминокислотными остатками. Проверена функциональность данных конструкций. Установлены важные различия в фотохимическом поведении СР1 и Гтр1 после совместной реконструкции в мембраны полярных липидов пурпурных мебран H.salinarum и химерных белков СР1+Гтр1 в нативных мембранах E.coli.

Значение работы.

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области биофизики, прежде всего при проведении спектроскопических работ и кристаллизации ретинальных белков.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на 25-ой конференции в Бланкенезе “Signaling in Sensory Systems” в Гамбурге, ФРГ и на 49-ой ежегодной конференции Биофизического общества в Лонг-Бич, США.

Публикации.

За время работы над диссертацией опубликована одна статья в реферируемом международном журнале.

Объём и структура диссертации.

Работа изложена на 122 страницах, иллюстрирована 41 рисунком и содержит 7 таблиц. Диссертация состоит из введения и четырех глав, включая обзор литературы. Список цитированной литературы содержит наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

Первая глава Первая глава cодержит критический обзор современной литературы, посвящённый нескольким темам:

- ретинальсодержащие пигменты археабактерий, - свойства сенсорного родопсина 1, его трансдьюсера и их комплекса, - свойства сенсорного родопсина 2, его трансдьсюера и их комплекса, - представление о молекулярных механизмах передачи сигнала.

Архебактерии реагируют на свет, используя сенсорные родопсины 1 и 2, близко родственные ионным насосам бактериородопсину (БР) и галородопсину (ГР). Все эти белки состоят из 7 трансмембранных спиралей, активируются светом и имеют хромофор транс-ретиналь, соединенный через протонированное основание Шиффа со спиралью G. Поглощение фотона приводит сначала к изомеризации ретиналя в 13-цис-ретиналь, а затем к конформационным изменениям в самом белке. Рецептор, в свою очередь, инициирует структурные изменения в белке-партнере – галобактериальном трансдьюсере. Цитоплазматический домен этого мембранного белка высоко гомологичен хеморецепторам эубактерий, первому звену в двухкомпонентной сигнальной цепи.

В первой части первой главы описаны особенности физиологии Halobacterium salinarum в зависимости от различных условий окружающей среды. В следующих четырех подглавах обзора литературы рассматриваются основные свойства системы СР+Гтр: первичная структура компонетов этой системы, их сравнение с родственными белками, основные принципы фототаксиса. Особое внимание уделено вопросу о природе взаимодействий между белками-партнерами СР1 и Гтр1. Затем обсуждаются все ступени передачи сигнала: от падающего фотона определенной частоты до изменения направления движения клетки. В заключении подведен итог о современном состоянии этой области науки и указаны нерешенные задачи и их связь с данной работой.

Вторая глава.

Вторая глава состоит из 4-х частей. Первая часть содержит список всего использованного оборудования, реактивов и буферных растворов. Во вторую часть вошли описания методик и необходимых протоколов работы с клетками E.coli. В третьей части приведены протоколы по очистке и приготовлению образцов белка. Последняя, четвертая, часть главы посвящена спектроскопическим методам, использованным в работе, таким как спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой области и рамановская спектроскопия.

Третья глава.

В третьей главе описано картирование региона взимодействия между сенсорным родопсином 1 (СР1) и его белком-партнером галобактериальным трансдьюсером 1 (Гтр1).

СР1 может находиться в двух сигнальных состояниях, каждое из которых может быть активировано светом определенной частоты. После освещения основного (невозбужденного) состояния СР587 оранжевым светом образуется долгоживущее переходное состояние – СР373. Скорость образования СР373 в 000 раз выше, чем скорость его распада, поэтому возможно накопление физиологически значимых его концентраций как после короткой вспышки белого света, так и при постоянном освещении оранжевым светом.

Для передачи сигнала внуть клетки необходим белок-партнер Гтр1. После гомологической экспрессии СР1 в присутствии и в отсутствие Гтр1 оказалось, что скорость релаксации СР373 в отсутствие Гтр1 экспоненциально зависит от pH, в то время как скорость релаксации сигнального состояния комплекса постоянна в широком диапазоне pH.

Эта особенность фотофизиологии комплекса СР1:Гтр1 предоставляет удобный тест-критерий для определения взаимодействия между рецептором и трансдьюсером. Ранее было опубликовано, что самый короткий трансдьюсер, все еще взаимодействующий с СР1, имеет длину 147 N-концевых а.о. плюс дополнительные 36 а.о. на С-конце; делеция 125-250 а.о. препятствовала взаимодействию Гтр1 с СР1. Другая группа исследователей получила сходные результаты при удалении 66-165 а.о. Впоследстви были сконструированы химерные белки, состоящие из СР1 и Гтр1 и/или Гтр2, которые подтвердили, что специфичность взаимодействия с рецептором определяется в основном 2-мя трансмембранными спиралями трансдьюсера. Следует отметить, что все упомянутые выше работы проводились в мембранах H.salinarum после гомологичной экспрессии.

Ген sopI был амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с плазмиды pBlunt, содержащей ген sopI, а регион, кодирующий последних аминокислотных остатков был заменен олигонуклеотидом, кодирующим 10 гистидинов. Затем ПЦР продукт (sopI15His, несущий экспрессионный вектор рЕТ 11а по сайтам NdeI и BamHI. Полученные клоны анализировали с помощью рестрикционного анализа, их правильность подтверждали секвенированием.

Экспрессию СР1 проводили в клетках E.coli BL21(DE3) Codon Plus RP по известной схемe, но среду LB заменили на более питательную 2xTY и время экспрессии увеличили с 2 до 4 часов. Выход рекомбинантного белка при этом повысился, о чем свидетельствовал более интенсивный темно-синий цвет клеточных осадков.

Осадки растворяли в буфере FPср, клетки разрушали трехкратным пропусканием через пресс Френча. После ультрацентрифугирования окрашенный осадок, содержащий разрушенные мембраны и части клеточных стенок, ресуспендировали в солюбилизационным буфере с нейонным детергентом, додецилмальтозидом (ДМ). pH этого буфера очень важен и определяется взаимно противоречивыми требованиями к стабильности белка и его хорошему связыванию с носителем колонки. С учетом собственных экспериментальных данных был выбран pH 6.8. Повторным ультрацентрифугированием удаляли нерастворимые агрегаты мембран, при этом солюбилизированный СР1 находился в супернатанте.

Дальнейшую очистку осуществляли с помощью металлохелатной хроматографии. Связывание белка с носителем контролировали по окрашиванию смолы в синий буфером HMср после HWср для удаления присутствующего в HWср имидазола, серьезно ухудшающего качество и СР1: 1 – маркер, стабильность СР1. Поскольку белок нестабилен при 2 – СР1.

невысоких концентрациях соли и в присутствии имидазола, смыв белка с колонки производили, изменяя pH буфера. Мы использовали pH 4.5, а не 4.0, т.к. при смыве pH 4.0 часть СР1 необратимо деградировала, а выход функционального белка практически не увеличивался. Кроме того, чтобы уменьшить деградацию СР1 после очистки, pH полученной фракции немедленно доводили до 6.0 титрованием. Согласно нашим экспериментальным данным, СР1 наиболее стабилен в растворе детергента при рН 6.0 и 4 М NaCl.

Конечный выход очищенного СР1 составил около 3 мг/л клеточной культуры.

Качество рекомбинантного СР1 оценивали двумя независимыми способами: с помощью гель-электрофореза в ДСН и измерения спектра поглощения в диапазоне длин волн от 250 до 700 нм.

количество примесных белков было обнаружены в образце очищенного СР1 (рис. 1) методом гель-электрофореза в ДСН.

Гомогенность препарата составила около 80%.

очищенного СР1 представлен на интенсивностей поглощения Рис. 2. Спектр поглощения СР1 в водном A280/A587 после очистки было в растворе 4 M NaCl, 50 мM MES pH 6.0, 0.05 % диапазоне 1.5-1.8, что является стандартной величиной для чистых препаратов СР1. Более высокие величины A280/A587 указывают на наличие примесных белков или других нежелательных компонентов, например, опсина без ретиналя. Для повышения стабильности СР1 при экспрессии последние 15 а.о. были заменены на гистидиновый олигопептид;

фотохимические свойства белка при этом не изменялись.

Были созданы две конструкции, кодирующие полноразмерный ген htrI.

Они отличались лишь олигопептидами на С-конце белка. Эксперименты показали, что полноразмерный Гтр1 с 6 гистидинами на С-конце плохо связывается со смолой Ni-NTA и легко смывается даже при низких концентрациях имидазола. Поэтому в дальнейшем использовали плазмидную конструкцию, кодирующую strep-tagII на С-конце полипептидной цепи Гтр1.

Очистку солюбилизированного Гтр1 производили на колонке со стрептактином. Данный подход улучшил специфическое связывание и повысил качество рекомбинантного белка. К сожалению, элюат содержал слишком много примесных белков, поэтому было решено найти оптимальные условия для дополнительной очистки белка после аффинной хромотографии. Для этого Гтр1 диализовали в течение ночи против стократного объема 20 мМ Трис-HCl рН 7.2, 0.05% (вес/об) ДМ и наносили на три ионобменных колонки (DEAE sepharose FF, Q sepharose FF и ANX sepharose FF), уравновешенные тем же буфером. Белок элюировали градиентом NaCl от 0 до 1 М в исходном буфере.

Наилучшее разрешение пиков было достигнуто при элюции с ANX sepharose FF, поэтому для дальнейшей работы был выбран этот носитель.

Для конструирования укоро-ченных генов htrI использовали 5’-праймер, содержащий олигонуклеотид для strep-tagII (10 дополнительных аминокислотных остатков) после стартового кодона. Различные 3’-праймеры, содержащие HindIII сайт рестрикции позади стоп-кодона и регион, кодирующий последнюю желаемую аминокислоту перед стоп-кодоном были использованы для амплификации с помощью ПЦР. Полученный делетированный белок (структура N-конца: MASWSH PQFEKTIAW...) назывался StrepГтр... плюс номер последней аминокислоты в гене дикого типа (рис. 3).

разрезанный по NdeI/HindIII вектор pET 27b+.

Чтобы исключить возмож-ное влияние strep-tag II на свойства трансдьюсера, анало-гичная конструкция с олигопептидом, но на С-конце белка, названная Гтр52-Strep. Этот указывают на количество аминокислотных остатков, strep-tag II фрагмент ДНК обозначен Strep.

был заклонирован в pET 11a. Экспрессию генов делеционных мутантов проводили аналогично экспрессии гена полноразмерного белка.

Экспрессированные белки очищали по аналогии с полноразмерным Гтр1Strep: солюбилизировали мембранную фракцию разрушенных при пропускании через пресс Френча клеток в буфере с ДМ, затем наносили супернатант на стрептактиновую колонку. После промывки буфером для нанесения белок элюировали 2.5 мМ дистиобиотина. Выход очищенных делеционных мутантов Гтр1составил около 0.6-0.8 мг/л клеточной культуры.

Для исследования свойств сенсорных родопсинов в окружении, близком к нативному, белки реконструировали в полярные липиды пурпурных мембран.

Для этого рецептор в растворе детергента смешивали с полярными липидами пурпурных мембран (ПЛПМ) при pH 6.0. Детергент удаляли, инкубируя раствор белка с BioBeads SM2 в течение ночи при +4С. Реконструированный белок осаждали центрифугированием. Осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в требуемом буфере. Переход белка из детергента в липиды легко отслеживался с помощью центрифугирования: окрашенный белок оставался в мембранной фракции, а супернатант становился бесцветным.

Анализ фракций супернатанта и липидного осадка на гель-электрофорезе в ДСН выявил, что белки были исключительно в мембранной фракции, состоящей из осажденных мембран. Более 80% изначально взятого СР успешно встраивалось в ПЛПМ, как было определено по поглощению на нм. К сожалению, оценка качества реконструированного белка была затруднена из-за сильного фонового рассеяния липидов на 280 нм.

Для проверки взаимодействия СР1 и Гтр1 in vitro в липидном окружении, мы проводили совместную реконструкцию белков в мембраны ПЛПМ.

Рецептор в растворе детергента смешивали с трансдьюсером или одним из его делеционных мутантов в молярном соотношении 1:2, затем добавляли липиды и оставляли на час на льду. После добавления BioBeads SM2 образец инкубировали в течение ночи при температуре +4°С. Реконструированные белки осаждали центрифугированием, и осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в буфере с нужным pH. Реконструкция полноразмерного Гтр1 с СР1 по невыясненным причинам не удалась.

Реконструированный СР1 содержал ретиналь, что подтверждалось синим цветом образца. Доказательством функциональности являлось время полураспада t1/2 M-состояния реконструированного белка. В фотоцикле СР1 Мсостояние (СР373) прямо переходит в основное состояние (СР587). Переход является реакцией первого порядка, что позволяет говорить о распаде Мсостояния СР373 как о восстановлении основного состояния белка, СР587.

Суспензию мембран с реконструированным СР1 облучали интенсивным желтым светом и измеряли кинетику восстановления СР373 в основное состояние на 550 нм. Такая длина волны была выбрана из-за более благоприятного для измерений отношения сигнал:шум, чем на 360 нм (прямое измерение распада М-состояния). Зависимость t1/2(pH) была экспоненциальной, в полном соответствии с литературными данными (рис. 4).

Как было определено ранее, t1/2 распада М-состояния галобактериальные липиды, колеблется в диапозоне от 0. до 2.2 с при рН 5.5. Следует отметить, что окружение белка также оказывает сильное фотоцикла: она сильно зависит от наличия детергента и типа используемых липидов, что было показано и для БР.

Времена при щелочных рН (t1/ = 11.3 с, при рН 7.3 и t1/2 = 68.6 с при рН 8.0) как минимум на порядок больше, чем описанные ранее (800 мс при рН 7.5 и 4 с при рН 7.0). Различия в t1/2 могут объясняться тем, что опубликованные измерения проводились в нативных галобактериальных мембранах. Хотя полярные липиды, используемые в работе, также выделены из H.salinarum, они не точно воссоздают естественное окружение СР1.

Критерием для оценки взаимодействия двух белков после совместной реконструкции служила кинетика восстановления основного состояния СР1.

Первоначально был проанализирован участок между 147 и 124 N-концевыми а.о. Для этого сконструировали 4 укороченных Гтр1: StrepГтр147 в качестве положительного контроля, StrepГтр124 в качестве отрицательного контроля (в соответствии с литературными данными) и два Гтр1 промежуточной длины – StrepГтр130 и StrepГтр130. Во избежание возможного влияния отрицательно заряженных боковых цепей все мутанты имели олигопептид strep-tagII на Nконце.

Тесты по исследованию зависимости кинетики СР1 от рН указали на успех реконструкции рецептора со всеми мутантными Гтр1, включая StrepГтр124. Чтобы прокартировать регион между 124 и 97 аминокислотными остатками Гтр1, были заклонированы и проэкспрессированы гены новых укороченных мутантных трансдьюсеров.

процедур очистки и совместной реконструкции СР1 с этими белками (StrepГтр116, StrepГтр110, StrepГтр106, StrepГтр97) также было продемонстрировано Последняя группа делеционных мутантов Гтр1 (StrepГтр87, StrepГтр84, StrepГтр71, StrepГтр61, StrepГтр56 и StrepГтр52) имела целью картировать участок, Рис. 5. Кинетика изменения поглощения СР непосредственно прилегающий к (линия А) при рН 5.8, СР1:StrepГтр147 (линия мембране. Самым коротким Гтр1, В) при рН 5.5 и СР1:StrepГтр52 (линия С) при влияющий на кинетику СР1 при рН 5.2, измеренные на 550 нм после совместной реконструкции, оказался StrepГтр52, состоящий только из 2-х трансмембранных спиралей. Существенных различий в поведении между СР1:StrepГтр52 и СР1:Гтр52Strep обнаружено не было, что позволяет сделать вывод о том, что олигопептид strep-tagII не модулирует кинетику фотоцикла исследованных в работе комплексов.

Кинетика восстановления основного состояния СР1 после освещения желтым светом регистрировалась для СР1 с делеционными мутантами Гтр различной длины после реконструкции в мембраны ПЛПМ из H.salinarum.

Изменения поглощения на 550 нм после облучения желтым светом изображены на рис. 5 для свободного СР1 (линия А), СР1:StrepГтр147 (линия В) и СР1:StrepГтр52 (линия С). Время восстановления основного состояния каждого образца были получены после усреднения нескольких экспериментальных кривых и их последующего апроксимирования суммой соответствующих экспонент.

Ясно, что присутствие трансдьюсера существенно замедляет скорость фотореакции (кривые В и С). Кроме того, видно, что самый длинный трансдьюсер (147 а.о.) менее эффективено замедляет фотоцикл СР1 (t1/2 ~ 27 с), чем более короткий фрагмент, состоящий только из 2-х трансмембранных спиралей (52 а.о., t1/2 ~ 44 с).

Обработка экспериментальных данных выявила, что кинетика восстановления основного состояния была всегда биэкспоненциальной (с наличием быстрой и медленной компонент, см. ниже) при кислом рН, независимо от длины трансдьюсера. Тот факт, что t1/2 быстрой компоненты было близко к времени полужизни свободного СР1 (t1/2 = 1.35 с), указывает на присутствие определенного количества несвязанного рецептора даже после добавления Гтр1 при реконструкции более чем в двукратном избытке. Это может быть объяснено низкой константой связывания рецептора и трансдьюсера или неблагоприятными условиями для комплексообразования.

Полученные t1/2 для медленной компоненты представлены в табл. 1.

Табл. 1. Сравнение кинетики восстановления основного состояния после реконструкции СР1 с укороченными трансдьюсерами Гтр1.

Кинетика восстановления основного состояния рецептора после совместной реконструкции с самыми короткими трансдьюсерами, длиной от до 71 а.о., характеризовались t1/2, лежащими в узком диапазоне от 44 до 48 с, в то время как t1/2 после реконструкции с более длинными мутантами было приблизительно в 2 раза ниже (t1/2 =18-27 с).

В отсутствии трансдьюсера кинетика восстановления основного состояния СР1 после облучения желтым светом сильно зависит от рН (t1/2 = 1. с при рН 5.8 и 68.6 с при рН 8.0). Ранее было показано, что связывание трансдьюсера с рецептором сильно уменьшает или сводит на нет зависимость от pH [1]. Поэтому кинетика после освещения служит индикатором взаимодействия между СР1 и его белком-партнером – Гтр1. На рис. приведены зависимости кинетики восстановления основного состояния от рН:

СР1 (), СР1 после реконструкции с самым коротким делеционным мутантом Гтр1, StrepГтр52 () и с самым длинным делеционным мутантом Гтр1, StrepГтр147 (). Из этих данных следует, что зависимость времени распада СР373 от рН сильнее подавляется в присутствии более коротких фрагментов Гтр1.

При нейтральном или слабощелочном рН t1/2 различных комлексов лежат в диапазоне от 37.7 до 81.2 с. Мы предполагаем, что это обусловлено неравномерным распределением зарядов во вторичной структуре С-концевого цитоплазматического домена различных укороченных трансдьюсеров. Важная роль протонируемых аминокислотных остатков в регионе, прилегающем к мембране, была показана ранее, также как и влияние точечных мутаций в этом регионе на скорость фотоцикла СР1 в комплексе с Гтр1. Хотя кинетические данные, полученные с комплексами с трансдьюсерами постоянной длины и единичными заменами, трудно сравнивать с данными, полученными с использованием делеционных мутантов Гтр1, тем не менее, очевидно, что аминокислотные остатки этого региона играют важную роль в регуляции фотоцикла СР1.

убедительные доказательства комплексообразования между сконструированными делеционными мутантами Гтр1, приведенные в предыдущей главе результаты являются во многом противоречивыми. Так, времена восстановления основного состояния СР делеционными мутантами Гтр сильно зависили от условий реконструкции в ПЛПМ.

Реконструкцию мембранных химерный белок СР1+Гтр147 ()[2].

белков в липидное окружение трудно контролировать из-за множества параметров; при реконструкции комплексов из отдельных компонентов ситуация усложняется еще больше. Так, на образование и/или функциональность комплекса могут влиять: тип используемых липидов и степень их очистки, количество липидов, отношение количества вещества белковых компонентов комплекса, тип детергента и степень его очистки, отношение количества вещества детергента к количеству липидов и смолы Bio-Beads SM-2, ионная сила раствора, температура и продолжительность реконструкции.

Даже незначительное изменение одного из параметров может вести к изменению кинетики образования комплекса, влиять на его функциональность, изменять стехиометрию комплекса и даже его геометрию (взаимную ориентацию молекул друг относительно друга). Полярные липиды пурпурных мембран H.salinarum считаются для сенсорных родопсинов окружением, близким к нативному. Результаты указывают на то, что липиды, возможно, не влияя на фотоцикл СР1, влияют на его взаимодействие с Гтр1.

Во время работы над диссертацией была опубликована работа Чена и Спудича (Chen and Spudich) [2]. Авторы этой работы исследовали фотоцикл химерного СР1, соединенного через 9-членный гибкий линкер с укороченными Гтр1. Результаты, полученные ими после анализа мембранной фракции клеток H.salinarum, отличались от наших результатов (рис. 6).

Рис. 7. Схема химерных белков СР1 и Гтр1, исследованных в данной работе. Транс- в составе химерного белка, мембранные спирали обозначены – ТМ, подавляющий рН зависимость сенсорный родопсин 1 – СР1, а цифры рецептора от рН, имел длину указывают на количество аминокислотных аминоклислотный остаток. В СР1 от рН, но времена распада М-состояния связанного с трансдьюсером рецептора соответсвовали времени распада свободного СР1 при рН 7.0.

Для проверки указанного расхождения в результатах мы сконструировали сходные химерные белки (рис. 7). В отличие от белков, опубликованных в работе Чена и Спудича, в нашем случае СР1 и Гтр1 не были разделены гибким линкером. Чтобы исключить возможное влияние реконструкции, измерения проводили непосредственно в мембранах E.coli после индукции экспрессии.

Было создано 4 гибридных белков на основе СР1, соединенных с укороченным мутантом Гтр1 «встык»: СР1-Гтр147-his, СР1-Гтр71-his, СР1Гтр52-strep, СР1-Гтр-53-147-his.

Для конструирования химерных белков использовали ПЦР. В первых двух ПЦР амплифицировали выбранные участки гена htrI с плазмиды pBlunt, кодирующей полноразмерный ген htrI, и ген sopI. Если праймеры на 5’концевые последовательности совпадали с используемыми для клонирования отдельных белков, то внутренние праймеры, содержали не только 3’-концевую последовательность необходимых генов, но и гомолочный участок, необходимый для дальнейшего лигирования двух участков ДНК в 3-ей ПЦР, которой предшествовала денатурация двуцепочной ДНК в течение 3-х мин и медленное охлаждение до комнатной температуры. Амплифицированный продукт ПЦР содержал те же сайты рестрикции для клонирования, что описанные ранее конструкции. Правильность полученных клонов после лигирования в экспрессионные векторы была проверена секвенированием.

Клетки E.coli BL21(DE3) Codon Plus RP трансформировали следующими плазмидами: pET TOPO 101-sopI-htrI-147-his, pET 27b+-sopI-htrI-71-his, pET 11a-sopI-htrI-52-strep и pET 27b+-sopI-htrI-53-147-his. Экспрессию проводили по схеме, описанной ранее для СР1. Клеточные осадки растворяли в буфере FPср, клетки разрушали прессом Френча. Центрифугированием отделяли мембранную фракцию, содержащую гибридные белки в мембранах E.coli и растворяли в 4 М NaCl и 50 мМ Трис-малеиновой кислоты с требуемым рН.

Дальнейший анализ проводили по схеме, описанной ранее для реконструированных белков.

Полученные данные в опубликованными, но имеются и сущенственные отличия (рис.

8). Так, t1/2 восстановления мембранах E.coli при рН 5. оказалось равным 1.2 с, а при рН 7.5 – 22.1 с, что хорошо согласуется с полученными нами результатам в ПЛПМ и соответствует результатам Чена восстановления основного СР1-Гтр147-his практически не 1-52, SRI-HtrI 1-71 – СР1-Гтр1 1-71, SRI-HtrI 1зависили от рН и лежали в 147 – СР1-Гтр 1-147.

диапазоне от 0.4 до 0.6 с, также полностью согласуясь с опубликованными. Однако t1/2 восстановления основного состояния для химерных комплексов СР1-Гтр52-strep и СР1-Гтр53his полностью совпадало с таковым для свободного рецептора в мембранах E.coli; в то время как химерный белок, соответствующий СР1-Гтр52, по результатам Чена и Спудича, также демонстрировал экспоненциальную зависимость t1/2 от рН в мембранах H.salinarum, но в ~10 раз более быструю, чем свободный СР1 при тех же условиях (рис. 6 и 8).

На основании приведенных данных можно сделать вывод, что совместная реконструкция СР1 и Гтр1 из отдельно очищенных белков еще недостаточно изучена и может приводить к серьезным артефактам, например, сдвигать в ту или иную сторону константы образования комплексов или же модулировать фотохимические свойства СР1 в составе комплексов. Это косвенно подтверждается результатами гомологичной экспрессии СР1 и делеционных мутантов Гтр1.

Экспоненциальная зависимость времени распада М-состояния свободного СР1 от внешнего рН означает репротонирование свободного основания Шиффа протоном из внешней среды. Исчезновение зависимости времени распада СР от внешнего рН означает, что: либо (i) рецептор принимает некую «закрытую»

конформацию, стерически ограничивающую доступность основания Шиффа для протона извне и/или (ii) рКа протонируемых групп внутри рецептора сдвигаются таким образом, что репротонирование основания Шиффа извне становится энергетически невыгодным.

После совместной реконструкции в ПЛМП из H.salinarum СР1 и всех исследованных в работе делеционных мутантов Гтр1 из отдельно очищенных белков времена восстановления основного состояния СР1 становятся характерными для несвязанного рецептора при щелочных рН. Из описанных выше результатов можно сделать вывод, что двух трансмембранных спиралей трансдьюсера в ПЛПМ достаточно для индуцирования конформационных изменений в рецепторе, приводящих к закрытию протонного канала в СР1.

Скорее всего, это является следствием влияния ненативного липидного окружения. Увеличение t1/2 восстановления основного состояния после совместной реконструкции СР1 с более длинными мутантами Гтр1 (StrepГтр – StrepГтр147) может быть объяснено через электростатическое влияние на СР многочисленных заряженных групп цитоплазматической части трансдьюсера.

В работе Чена и Спудича (Chen and Spudich) [2] был исследован фотоцикл химерного СР1, соединенного через 9-членный гибкий линкер с укороченными Гтр1. На основании данных измерений распада М-состояния указанных конструкций в нативных мембранах H.salinarum, авторы предполагают, что область Гтр1, находящаяся между 62-66 а.о., ответственна за закрывание цитоплазматического протонного канала СР1. Вопреки нашим наблюдениям, они приводят время распада М-состояния гибридного белка, состоящего из СР и 2-х трансмембранных спиралей Гтр1, примерно в 10 раз быстрее, чем t1/ свободного рецептора при аналогичном рН. В указанной работе трансмембранных спирали трансдьюсера как бы «расширяли» протонный канал рецептора, на порядок увеличивая время распада СР373 и при этом сохраняя его экспоненциальную зависимость от внешнего рН. Все химерные белки, состоящие из СР1 и 1-72, 1-85 и 1-147 а.о. Гтр1, имели практически одинаковые времена распада М-состояния, не зависящие от рН и соответствующие временам распада СР373 при рН 5.6-5.8.

Закрытие протонного канала СР1 подразумевает худшую доступность основания Шиффа для протонов извне и, следовательно, более медленную по сравнению со свободным СР1 скорость репротонирования основания Шиффа (а, значит, и распада М-состояния) при том же значении рН. Одним только закрытием канала трудно объяснить времена распада М-состояния более длинных химерных белков, состоящих из СР1 и 1-72, 1-85 и 1-147 а.о. Гтр1.

Ясно, что если бы цитоплазматическая часть трансдьюсера лишь механически закрывала канал, то времена распада М-состояния этих химерных белков соответствовали бы временам распада М-состояния свободного рецептора при щелочных рН. Значит, в комплексе трансдьюсер либо (i) предоставляет донорную группу и/или донорные группы для протонирования основания Шиффа в М-состоянии, либо (ii) сдвигает рКа протонируемых групп внутри рецептора таким образом, что репротонирование основания Шиффа происходит изнутри. Многочисленные попытки определить донорные группы в Гтр1 до сих пор не увенчались успехом; наиболее вероятным кандидатом на роль внутреннего донора в СР1 является His166.

Из наших измерений времен восстановления основного состояния указанных конструкций в мембранах E.coli следует сказать, что химерный белок СР1-Гтр52 не вызывал ускорения восстановления основного состояния на порядок, а полностью повторял поведение СР1 при тех же условиях. Химерные белки с более длинными трансдьюсерами (СР1-Гтр71 и СР1-Гтр147) не имели рН-зависимости восстановления основного состояния. При этом характерных времена его распада также лежали в области, соответствующей кислым рН для СР1, что также противоречит гипотезе чисто «механического» закрывания канала. Интересно, что химерные белки, содержащие только цитоплазматическую часть трансдьюсера и не включавшие в себя двух трансмембранных спиралей Гтр1, во обоих случаях демонстрировали ответ, характерных для свободного рецептора.

Мы предполагаем, что две трансмембранных спирали трансдьюсера служат только для связывания с рецептором, но сами по себе не изменяют его свойств в смысле рН-зависимости времени распада М-состояния. Тем не менее, эти спирали необходимы для модулирования времени восстановления основного состояния СР1 в комплексах рецептора с более длинными трансдьюсерами; при отсутствии трансмембранного домена Гтр1 химерные белки демонстрируют времена восстановления основного состояния, аналогичные таковым для свободного СР1. Важно, что времена восстановления основного состояния химерных белков СР1-Гтр71 и СР1-Гтр147 достаточно коротки и соответствуют таким же временам для свободного СР1 при рН ~ 5.0.

Это еще раз говорит о том, что взаимодействие с трансдьюсером сдвигает рКа протонируемых групп внутри рецептора таким образом, что репротонирование основания Шиффа происходит изнутри с постоянной скоростью, очевидно, лишь слабо зависящей от внешнего рН, что подтверждается титрованием Asp свободного рецептора и гибридных белков [2].

В ПЛПМ взаимодействие со всеми делеционными мутантами трансдьюсера приводит к закрытию протонного канала, предположительно за счет неспецифических электростатических и гидрофобных взаимодействий, обусловленных ненативным окружением. Это подтверждается и отсутствием быстрого репротонирования: сдвиг рКа донорной группы внутри рецептора в таком случае, видимо, невозможен, что приводит к длинным временам репротонирования основания Шиффа.

Основные результаты третьей главы.

1. Создана экспрессионная конструкция рЕТ 11а-sopI-his. Системы экспрессии и очистки СР1 были существенно модифицированы по сравнению с ранее опубликованными, что увеличило степень чистоты белка. Качество рекомбинантного СР1 было проанализировано с помощью гель-электрофореза в ДСН, который выявил гомогенность белка после очистки – 80%.

2. Спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях показала, что спектр полученного СР1 соответствует спектру белка, опубликованному ранее.

Соотношение интенсивностей поглощения СР1 после очистки на длинах волн 280 и 587 нм A280/A587 равно 1.5-1.8, что дополнительно свидетельствует о высокой чистоте белка.

3. Получены 2 экспрессионных плазмидных конструкции, содержащие полноразмерный ген Гтр1, отличающиеся дополнительными олигопептидами, необходимым для очистки, – strep-tagII и his-tag. После серии экспериментов найдена оптимальная двухступенчатая схема очистки, включающая в себя очистку на стрептактине и последующую ионобменную хроматографию.

4. С помощью мутагенеза создано 15 делеционных мутантов Гтр1. Все белки были впервые успешно проэкспрессированы в клетках E.coli и очищены. Выход очищенных делеционных мутантов Гтр1 составил около 0.6-0.8 мг/л клеточной культуры.

5. Найдены условия функциональной реконструкции сенсорного родопсина в полярные липиды пурпурных мембран. Более чем 80% изначально взятого СР успешно встраивалось в ПЛПМ.

6. Кинетика восстановления основного состояния СР1, реконструированного в полярные мембраны, имеет экспоненциальную зависимость от рН в соответствии с литературными данными.

7. После совместной реконструкции СР1 со всеми делеционными мутантами Гтр1 в полярных липидах пурпурных мембран из H.salinarum происходит подавление экспоненциальной зависимости восстановления СР373 в основное состояние.

8. Эффективность подавления зависимости времени восстановления СР373 в основное состояние от рН зависит от длины цитоплазматического домена Гтр и сильнее выражена после совместной реконструкции СР1 с короткими трансдьюсерами (StrepГтр52-StrepГтр71) в полярных липидах пурпурных мембран из H.salinarum.

9. Обнаружены различия между поведением СР1 после совместной реконструкции со всеми делеционными мутантами Гтр1 из отдельно очищенных белков в полярных липидах пурпурных мембран из H.salinarum и поведением химерных белков СР1 + Гтр1 в нативных мембранах E.coli, свидетельствующие о важности влияния липидного окружения на поведение системы СР1 + Гтр1.

10. Предложены возможные объяснения молекулярных механизмов зависимости скорости распада М-состояния СР1 от рН в отсутствие трансдьюсера и в комплексе с Гтр1 при разных условиях.

Четвертая глава.

В четвертой главе описана функциональная характеризация сенсорного родопсина 2 (СР2) из Halobacterium salinarum, экспрессированного в E.coli.

Фрагмент ДНК, содержащий ген sopII и полинуклеотидный участок, кодирующий 6 дополнительных остатков гистидина на С-конце полипептидной цепи, и фланкированный необходимыми сайтами рестрикции, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). После лигирования в экспресионный вектор pET 27b+ положительные клоны подвергали рестрикционному анализу и секвенировали, чтобы подтвердить отсутствие возможных ошибок ДНК-полимеразы.

Следующим шагом был поиск оптимального экспрессионного штамма среди модифицированных штаммов E.coli BL21(DE3). Компетентные клетки 5ти разных штаммов трансформировали плазмидой рЕТ 27b+-sopII-his, а затем проводили пробную экспрессию по стандартной схеме. Была показана экспрессия СР2 в двух штаммах – BL21(DE3) Star и BL21(DE3) Codon Plus RP, последний был выбран для дальнейшей работы.

На основании приведенных выше данных проводили экспрессию СР2 и подбирали оптимальную схему его очистки. Средний выход очищенного белка составил 3-4 мг/л клеточной культуры. Выход был сравним с выходом после экспрессии СР1 и значительно выше выхода СР2 из N.pharaonis (около 1 мг/л).

Для исследования свойств СР2 в окружении, близком к нативному, белок реконструировали в полярные липиды пурпурных мембран (ПЛПМ). Рецептор в растворе детергента смешивали с ПЛПМ при pH 6.0. Детергент удаляли, инкубируя раствор белка с BioBeads SM2 в течение ночи при +4С.

Реконструированный белок осаждали центрифугированием. Осадок, содержащий мембранную фракцию, ресуспендировали в требуемом буфере.

Переход белка из детергента в липиды легко отслеживался с помощью центрифугирования:

мембранной фракции, а супернатант становился бесцветным. Анализ фракций супернатанта и липидного осадка на гель-электрофорезе в ДСН выявил, что белок был исключительно в мембранной фракции. К сожалению, только половина молекул сохраняла хромофор.

Анализ качества рекомбинантного СР2 с помощью гель электрофореза в ДСН выявил высокую гомогенность белка после очистки – 80-90%. На рис. 9А приведена характерная гель-электрофореграмма СР2. Нижняя мажорная полоса чуть выше полосы, соответствующей 20 кДа маркера, на гельэлектрофореграмме соответствует мономеру (26 102 Да), вторая полоса чуть ниже полосы маркера в 50 кДа – димеру СР2 (52 205 Да), что также подтверждается иммуноблоттингом (рис. 9B).

Димеры образуются только во время очистки, т.к. первоначальный анализ экспресии и его растворимости выявил наличие одних только мономеров белка.

В последовательности СР2 содержится один цистеин, Cys25. По данным компьютерного выравнивания последовательностей 4-х родопсинов из H.salinarum он расположен в первой трансмембранной спирали, в участке, прилегающем к цитоплазматической петле. Возможно, солюбилизация СР молекулами детергента оголяет этот участок, провоцируя образование цистина.

Рис. 10. Спектр поглощения очищенного Полученные данные были СР2 в ультра-филолетовой и видимой части обработаны, и на их основании была спектра в 4М NaCl, 50 мМ MES pH 6.0, 0.05% ДМ (вес/об).

присутствует два основных пика: пик 26 053 ± 2 Да может соответствовать молекулярной массе модифицированного (+80 Да) СР2 с отщепленным Мet (25 971.4 Да); второй пик (52 106 ± 4Да) соответствует массе димера основного продукта. Добавление -МЭ уменьшало интенсивность второго пика, из чего можно заключить, что образование по меньшей мере части димеров вызвано окислением цистеинов.

Масс-спектрометрические данные выявили наличие посттрансляционной модификации СР2. Известно, что длина боковой цепи аминокислотного остатка, следующего за первым метионином в начале трансляции, влияет на вероятность отщепления этого метионина после окончания синтеза белка. Если за метионином следует аланин, то вероятность отщепления метионина около 95.8%. Это явление наблюдалось при экспрессии БР, ГР и СР2 из N. pharaonis.

Для оценки функциональности экспрессии гена sopII в клетках E.coli были проанализированы спектр поглощения и фотоцикл СР2 в солюбилизированном состоянии и реконструированном в полярные мембраны, а также исследован хромофор белка с помощью рамановской спектроскопии.

На рис. 10 представлен спектр поглощения СР2. Он имеет два максимума поглощения: один, на длине волны 487 нм, соответствует поглощению полностью-транс ретиналя, ковалентно связанного с основанием Шиффа, другой, на длине волны 280 нм, – общее поглощение ароматических аминокислотных остатков белка. Хорошим критерием качества белка служит отношение интенсивностей поглощения образца на длинах волн 280 нм и нм A280/A487, равное после очистки 1.7-2.0.

Спектр демонстрирует наличие двух плечей. Ранее охарактеризованное плечо (max = 457 нм) объясняют тонкой структурой хромофора. Второе плечо с максимумом 420 нм было впервые описано при очистке СР2 из H.salinarum и объяснено присутствием цитохромов в образце. Спектры экспрессированных в E.coli СР2 из N. pharaonis и БР также демонстрировали наличие примесей цитохромов. Полоса Сорета (Soret band) в этом участке спектра характиризуется сдвигом в длиноволновую область спектра при востановленной формы, по сравнению с окисленной. Добавления дитионита натрия (Na2S2O4) к образцу не вызвало изменений в спектре поглощения, поэтому эту полосу нельзя соотнести с поглощением цитохромов.

Следовательно, ее наличие также вызвано тонкой структурой хромофора. Эта гипотеза подтверждается наличием этих плечиков на спектре СР2 из N.

pharaonis.

Резонансное рамановское рассеяние – эффективный спектроскопический инструмент для избирательного изучения хромофора светочувствительных родопсинов. Околорезонансные условия облучения образца (ex = 752 нм) были выбраны, чтобы промежуточных состояний во Рис. 11. Резонансный рамановский спектр сохранении избирательного усиления полос ретиналя, что (прерывистая линия).

невозможно при резонансных условиях опыта из-за долгого времени фотоцикла. Вклад нерезонансного рассеяния опсина в спектр был пренебрежимо малым.

Рис. 11 демонстрирует резонансный рамановский спектр СР2, встроенного в ПЛПМ. Для сравнения приведен резонансный рамановский спектр БР. Все колебательные полосы в спектре БР уже расшифрованы, поэтому его спектр служит образцом сравнения для соотнесения полос спектров остальных археродопсинов.

Слабая полоса (1657 см-1) соотносится с колебанием С=N-H, связанного с основанием Шиффа ретиналя. Сдвиг этой полосы на 23 см-1 при замене H2O в буфере на D2O исключает возможное соотнесение этой полосы с нерезонансным рассеянием колебаний амида I пептидной связи. Частота растяжения С=N-H связи хорошо соотносится с этой частотой у других галобактериальных ретинальных белков (1640 см-1 в БР, 1632 см-1 в ГР и см-1 в СР1). Частота колебаний этой связи также близка к соответствующей частоте у родопсинов млекопитающих (1660 см-1) и указывает на сильные водородные связи ретиналя, связанного с основанием Шиффа. Интересно отметить, что СР2 из N.pharaonis имеет колебания растяжения С=N-H связи на длине волны 1650 см-1, т.е. на 7 см-1 ниже, чем его гомолог из H. salinarum изученный нами.

Самая интенсивная полоса резонансного рамановского спектра – это пик (1550 см-1), соответствующий колебаниям растяжения двойных связей (С=С) ретиналя. Частота этого пика коррелирует с максимумом поглощения СР2 в видимом свете – 490 нм. Соседняя полоса (1582 см-1) может быть отнесена к более энергичной моде двойных колебаний (вероятно, растяжение С13=С связей).

Идентифицирующий регион (fingerprint region) (~1100-1300 см-1), где преимущественно поглощают одинарные связи (С-С), очень чувствителен к конформации ретиналя. Полоса на 1200 см-1, соотносимая с растяжением С14С15, совпадает с БР. С другой стороны, полоса на 1162 см-1, отвечающая в основном за поглощение С10-С11 связей, сдвинута на 5 см-1 по сравнению с БР.

Две указанные полосы демонстрируют преобладание полность-транс ретиналя в СР2 из H.salinarum после гетерологической экспрессии в E.coli. Появление слабой полосы на 1184 см-1 указывает на присутствие небольшого количества 13-цис ретиналя в адаптированном к темноте образце.

Это согласуется с аналогичными результатами для гомологично экспрессированного СР2. Замена обычной интенсивность полосы на 1184 см-1 и сдвигает ее в более длинноволновую область. Чувствительность этой полосы к дейтерированию азота Шиффова основания согласуется с тем, что связь С=N-H находится с syn-конформации по образовавшегося под действием повышенной температуры. И, наконец, последняя заметная полоса на 1009 см- может быть соотнесена с модами качания в плоскости двух метильных групп цепи ретиналя, а слабые полосы (882 см-1 и см-1) – к модам качания водородов над плоскостью.

Каждое промежуточное состояние рецептора характеризуется максимумом поглощения на определенной длине волны, временем образования и распада. были записаны на 360, 475 и 525 нм и Для анализа и сравнения кинетики представлены в логариф-мическом фотоцикла солюбилизированного в ДМ и масштабе.

встроенного в ПЛПМ СР2 изменения А – СР2 солюбилизированный в спектров поглощения регистрировали на водном растворе 4 М NaCl, 50 мМ 3-х длинах волн: 490, 360 и 525 нм, что MES рН 6.0, 0.05% (вес/об) ДМ.

соответствует следующим максимумам В – СР2, реконструированный в состояние, 360 нм – М-состояние, на 525 сверху образовавшейся пленки нм одновременно фиксируются два состояния – К и О (530 и 540 нм, соответственно). Константы реакций первого порядка собраны в табл. 2, а сами изменения спектров поглощения представлены на рис. 12.

Табл. 2. Время полураспада промежуточных состояний СР2 в ДМ и ПЛПМ.

0.05% Образование и распад М-состояния лучше всего отслеживаются на нм. В присутствии детергента М-состояние образуется за 0.35 мс и распадается за 0.6 с. Встроенный в ПЛПМ СР2 демонстрирует в 4 раза более медленное образование М-состояния (=1.42 мс) и в два раза более медленный распад (=350 мс). Сдвинутые в красную область спектра промежуточные состояния К и О анализировали на длине волны 525 нм. Исходя из этих данных можно сказать, что время распада К-состояния СР2 быстрее в детергенте (0.05 мс), чем в липидном окружении (0.18 мс), а на образование и распад О-состояния окружение белка практически не влияет. О-состояние образуется с =0.48 с и =0.31 с для солюбилизированного и реконструированного белка, что согласуется с временами распада М-состояния, записанными на 360 нм. Это однозначно свидетельствует о том, что М-состояние переходит прямо в Осостояние. Распад О-состояния происходит с =13.3 с и =8.31 с для солюбилизированого и реконструированного СР2, соответственно.

Хотя кинетические характеристики промежуточных состояний сравнимы при разных способах приготовления образцов и находятся в согласии с уже опубликованными данными, данные указывают на различия во временных константах и их зависимость от окружения белка (см табл. 3.). Следует отметить, что описанный нами фотоцикл удлинен.

Табл. 3. Сравнение времен полураспада промежуточных состояний с литературными данными.

H.salinarum [3] Схожий эффект наблюдается для временных констант промежуточных состояний, особенно для времени распада О-состояния СР2 без трансдьюсера. В этих исследованиях белок был в нативном окружении. Для СР2, солюбилизированного в дигитонине, временные константы были существенно выше по сравнению с тем же белком в мембранах. В упомянутом случае, возможно, СР2 был очищен вместе с его трансдьюсером Гтр2. В таком случае оба упомянутых эффекта выстраиваются в логическую схему при анализе кинетики СР2, экспрессированного в E.coli без трансдьюсера, и затем солюбилизированного в ДМ.

Основные результаты четвертой главы.

1. Ген sopII был амплифицирован с клеток H.salinarum и успешно заклонирован в экспрессионный вектор рEТ 27b+. Впервые достигнута гетерологическая экспрессия СР2 в клетках E.coli.

2. Разработана эффективная методика очистки СР2 с помощью Ме-аффинной хроматографии. Выход чистого белка составил 3-4 мг/л клеточной культуры.

3. Найдены условия функциональной реконструкции СР2 в полярные липиды пурпурных мембран. Большая часть СР2 встраивалась в липиды, но только половина молекул сохраняла хромофор.

4. Анализ качества рекомбинантного СР2 с помощью гель-электрофореза в ДСН показал высокую гомогенность белка после очистки (80-90%) и наличие димеров белка, что было подтверждено иммуноблоттингом.

5. Масс-спектрометрические данные подтвердили наличие димеров СР2 и выявили 2 пострансляционных модификации – отщепление N-концевого Met и наличие неизвестной модификации +80 Да.

6. Спектр поглощения СР2 в ульрафиолетовой и видимой областях аналогичен спектру белка, выделенного из клеток H.salinarum.

7. Соотношение интенсивностей поглощения СР2 после очистки на длинах волн 280 и 487 нм A280/A487 равно 1.7-2.0, что дополнительно свидетельствует о высокой чистоте белка.

8. Данные резонансной рамановской спектроскопии свидетельствуют о наличии 13-цис ретиналя в основном состоянии СР2 и плотной системы водородных связей вокруг основания Шиффа, более характерной для родопсина млекопитающих, чем для гомологичного СР2 из Natronobacterium pharaonis.

9. В детергенте и липидных мембранах СР2 демонструирует удлиненный фотоцикл с наличием всех промежуточных состояний.

ВЫВОДЫ.

1. Система функциональной экспрессии сенсорного родопсина 1 из Halobacterium salinarum (СР1) в клетках Escherichia coli и его последующей очистки была существенно улучшена, что увеличило степень чистоты белка.

Разработана de novo система экспрессии в клетках E.coli и последующей очистки трансдьюсера 1 из Halobacterium salinarum (Гтр1) и 15 его делеционных мутантов. Выход очищенных делеционных мутантов Гтр составил около 0.6-0.8 мг/л клеточной культуры.

2. Проведена совместная реконструкция СР1 и делеционных мутантов Гтр1 в полярные липиды пурпурных мембран из H.salinarum. Показано, что самый короткий из исследованных в работе делеционных мутантов, Гтр1 длиной 52 Nконцевых а.о., подавляет зависимость времени восстановления основного состояния СР1 от pH при данных условиях.

3. Длина цитоплазматического домена Гтр1 влияет на кинетику восстановления основного состояния СР1 после совместной реконструкции в полярные липиды пурпурных мембран из H.salinarum.

4. Фотохимические свойства комплексов химерных белков СР1 + Гтр1 в мембранах E.coli отличаются от свойств СР1 после реконструкции с делеционными мутантами Гтр1 в полярные липиды пурпурных мембран из H.salinarum. Гтр1 длиной 52 N-концевых а.о. при данных условиях не подавляет зависимость времени восстановления основного состояния СР1 от pH.

5. Впервые разработана система гетерологической экспрессии сенсорного родопсина 2 из Halobacterium salinarum (СР2) в клетках E.coli и последующей высокоэффективной очистки. Выход функционального белка составил 3-4 мг/л клеточной культуры.

6. Первый резонансный рамановский спектр СР2 свидельствует о наличии заметного количества 13-цис ретиналя в основном состоянии СР2 и плотной системы водородных связей вокруг основания Шиффа, более характерной для родопсина млекопитающих, чем для гомологичного СР2 из Natronobacterium pharaonis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. O. Mironova, R. Efremov, B. Person, J. Heberle, I. Budyak, G. Bldt, R.

Schlesinger «Functional characterization of sensory rhodopsin II from Halobacterium salinarum in Escherichia coli»

FEBS Letters 579 (2005), pp. 3147-3151.

2. O. Mironova, R. Efremov, B. Person, J. Heberle, I. Budyak, G. Bldt, R.

Schlesinger «Characterisation of halobacterial SRII heterologously expressed in Escherichia coli»

Abstracts of the 25th Blankenese Conference “Signaling in Sensory Systems”, Hamburg, Germany, 21-25 May, 2005, p 68.

3. Ivan Budyak, Olga Mironova, Vijayalaxmi Manoharan, Georg Bldt, Judith KleinSeetharaman, Valentin Gordeliy, Ramona Schlesinger «Biophysical and biochemical characterization of a missing link in the archaeal signaling cascade»

Abstacts of the 49th Annual Biophysical Society Meeting, Long Beach, CA, USA, 12-16 February, 2005, 1768-Plat.

Список литературы.

1. Spudich,E.N. & Spudich,J.L. (1993) The photochemical reactions of sensory rhodopsin I are altered by its transducer J Biol Chem 268, 16095-16097.

2. Chen,X. & Spudich,J.L. (2004) Five residues in the HtrI transducer membraneproximal domain close the cytoplasmic proton-conducting channel of sensory rhodopsin I J Biol Chem.

3. Scharf,B., Pevec,B., Hess,B. & Engelhard,M. (1992) Biochemical and photochemical properties of the photophobic receptors from Halobacterium halobium and Natronobacterium pharaonis Eur J Biochem 206, 359-366.

4. Scharf,B., Hess,B. & Engelhard,M. (1992) Chromophore of sensory rhodopsin II from Halobacterium halobium Biochemistry 31, 12486-12492.



Похожие работы:

«Ефремов Денис Александрович РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ПОВЕДЕНИЕ РЕОФИЛЬНЫХ ВИДОВ РЫБ В РЕКАХ ВОСТОЧНОЙ ФЕННОСКАНДИИ 03.02.06 – ихтиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Институте биологии Карельского научного центра Российской академии наук доктор биологических наук Научный руководитель профессор Веселов Алексей Елпидифорович Кудерский Леонид...»

«Железов Роман Владимирович РАЗРАБОТКА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИНФОРМАЦИОННОСПРАВОЧНОЙ СИСТЕМЫ ПОИСКА ОПТИМАЛЬНЫХ ПУТЕЙ ПРОЕЗДА НА ПАССАЖИРСКОМ ТРАНСПОРТЕ Специальность 05.12.13 – Системы, сети и устройства телекоммуникаций. АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2009 Работа выполнена на кафедре телекоммуникационных сетей и систем в Московском физико-техническом институте (государственном университете). Научный руководитель : доктор...»

«Секиринский Денис Сергеевич...»

«Левина Сима Гершивна ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПОВЕДЕНИЯ 90Sr И 137Cs В ОЗЕРНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОСТОЧНО-УРАЛЬСКОГО РАДИОАКТИВНОГО СЛЕДА В ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ АВАРИИ 03.00.01–03 – радиобиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в ФГУН Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России и ГОУ ВПО Челябинский государственный педагогический университет Федерального агентства по образованию Научный...»

«ВЛАСОВА Елена Юрьевна ПРОФИЛАКТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ ИЗ ГРУПП ПОВЫШЕННОГО РИСКА ЗАБОЛЕВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ СРЕДСТВ 14.00.09 – педиатрия 14.00.26 – фтизиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2009 Диссертация выполнена на кафедре фтизиатрии и на кафедре реабилитологии факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Государственного образовательного учреждения высшего...»

«Корляков Константин Александрович ЧУЖЕРОДНЫЕ КОРОТКОЦИКЛОВЫЕ РЫБЫ В ВОДОЕМАХ ЮЖНОГО ЗАУРАЛЬЯ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург-2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменский государственный университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор МУХАЧЕВ Игорь Семенович Официальные оппоненты : доктор биологических наук БОГДАНОВ Владимир Дмитриевич кандидат биологических наук СИЛИВРОВ...»

«МАКАРОВ Андрей Сергеевич АЛГОРИТМЫ КОНТРОЛЯ И ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМ УПРАВЛЕНИЯ АВИАЦИОННЫМИ ГТД НА ОСНОВЕ НЕЙРОСЕТЕВЫХ МОДЕЛЕЙ И НЕЧЕТКОЙ ЛОГИКИ Специальность: 05.13.01 Системный анализ, управление и обработка информации (в промышленности) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Уфа – 2011 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Уфимский государственный авиационный технический университет на кафедре вычислительной техники и защиты информации Научный...»

«КУКОБА Антон Игоревич СЛИЯНИЯ И ПОГЛОЩЕНИЯ КАК ФОРМА ПОВЫШЕНИЯ КОНКУРЕНТОСПОСОБНОСТИ ПРЕДПРИЯТИЯ В УСЛОВИЯХ ГЛОБАЛИЗАЦИИ (НА ПРИМЕРЕ КОНДИТЕРСКОГО БИЗНЕСА) Специальность: 08.00.05 – “Экономика и управление народным хозяйством” (предпринимательство) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата экономических наук Москва 2009 2 Работа выполнена на кафедре менеджмента и предпринимательства Государственного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«ГАБИТОВ Руслан Фаритович МНОГОМЕРНОЕ МОДЕЛЬНО-ПРЕДИКТОРНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ПРОКАЛКОЙ КАТАЛИЗАТОРОВ КРЕКИНГА, ОСНОВАННОЕ НА АЛГОРИТМЕ С ИНТЕРВАЛЬНОЙ НЕОПРЕДЕЛЕННОСТЬЮ Специальность 05.13.06 – Автоматизация и управление технологическими процессами и производствами (в промышленности) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Уфа – 2012 2 Работа выполнена на кафедре автоматизированных технологических и информационных систем филиала ФГБОУ ВПО...»

«ГАСИЧ Екатерина Юрьевна ФЕНОМЕН СТИЛЯ В ОТЕЧЕСТВЕННОМ МУЗЫКОЗНАНИИ: ИСТОРИЧЕСКИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ НАУЧНЫХ КОНЦЕПЦИЙ Специальность 17.00.02 – музыкальное искусство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата искусствоведения Ростов-на-Дону 2012 Работа выполнена на кафедре теории музыки и композиции Ростовской государственной консерватории (академии) им. С.В. Рахманинова кандидат искусствоведения, профессор Научный руководитель : Тараева Галина Рубеновна доктор...»

«Макарова Наталья Петровна ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ДЕТСКОГО МУЗЕЯ КАК ФАКТОР СТАНОВЛЕНИЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ МЛАДШИХ ШКОЛЬНИКОВ Специальность 13.00.01 - общая педагогика, теория и история образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Самара - 2000 Работа выполнена на кафедре эстетического воспитания Самарского государственного педагогического университета Научный руководитель : кандидат исторических наук, доцент Т. А. Чичканова...»

«УШАКОВ Александр Александрович САМОУРАВНОВЕШЕННЫЕ ПОЛЯ НАПРЯЖЕНИЙ 01.02.04 - механика деформируемого твердого тела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Владивосток - 2006 Работа выполнена в Дальневосточном государственном техническом университете Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор физико-математических наук, профессор Гузев Михаил Александрович. Официальные оппоненты : доктор физико-математических наук,...»

«Глазкова Ирина Владимировна РАЗРАБОТКА ОСНОВ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА ОЧИСТКИ БЕТОНА, ЗАГРЯЗНЕННОГО ИЗОТОПАМИ ЦЕЗИЯ И СТРОНЦИЯ, C ПРИМЕНЕНИЕМ ХЕЛАТООБРАЗУЮЩИХ СОЕДИНЕНИЙ Специальность: 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2009 1 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет пищевых производств на кафедре...»

«Конченков Владимир Игоревич КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГРАФЕНА И СВЕРХРЕШЕТОК НА ЕГО ОСНОВЕ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЧАСТОТНЫХ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПОЛЕЙ И ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ 01.04.04 – Физическая электроника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Волгоград – 2012 Работа выполнена на кафедре Общая физика в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский...»

«Болотникова Ольга Радиковна ПРОБЛЕМЫ УРЕГУЛИРОВАНИЯ ЭТНОПОЛИТИЧЕСКИХ СЕПАРАТИСТСКИХ КОНФЛИКТОВ В XXI ВЕКЕ Специальность 23.00.04 – Политические проблемы международных отношений, глобального и регионального развития Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата политических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре мировой политики факультета мировой экономики и мировой политики Национального исследовательского университета Высшая школа экономики. Научный...»

«Высоцкая Марианна Сергеевна Между логикой и парадоксом: композитор Фарадж Караев Специальность 17.00.02 музыкальное искусство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора искусствоведения Москва 2012 1 Работа выполнена в Московской государственной консерватории имени П. И. Чайковского на кафедре теории музыки. Научный консультант : доктор искусствоведения, профессор Григорьева Галина Владимировна, профессор кафедры теории музыки Московской государственной...»

«УДК 556.555.6 + 574.64 Медянкина Мария Владимировна ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ЗАГРЯЗНЯЕМЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ Специальность 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 в Московском государственном университете им. Работа выполнена М.В. Ломоносова доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Филенко Олег Федорович доктор биологических наук, ведущий научный Официальные...»

«Камалова Эльвина Ильдаровна ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИНТЕРВАЛЬНОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ТРЕНИРОВКИ В ПОДГОТОВКЕ ПЛОВЦОВВЕТЕРАНОВ 35-50 ЛЕТ 13.00.04 – теория и методика физического воспитания, спортивной тренировки, оздоровительной и адаптивной физической культуры Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Набережные Челны - 2009 Диссертационная работа выполнена на кафедре теории и методики борьбы и восточных единоборств ФГОУ ВПО Камская...»

«Десятова Олеся Александровна АГАРИКОИДНЫЕ БАЗИДИОМИЦЕТЫ ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.00.24 – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Научный руководитель доктор биологических наук,...»

«МИХНО ИГОРЬ ВИКТОРОВИЧ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНТЕНСИВНАЯ ТЕРАПИЯ У ЖЕНЩИН С ГЕСТОЗОМ В ПЕРИОПЕРАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ 14.01.20. – анестезиология и реаниматология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Ростов-на-Дону – 2009 г. Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. доктор...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.