WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ДУМИНА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА

Роль мембранных транспортных белков в регуляции продукции

цефалоспорина С у Acremonium chrysogenum

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центре «Биоинженерия» Российской академии наук Научные руководители: кандидат биологических наук Эльдаров Михаил Анатольевич кандидат биологических наук Жгун Александр Александрович

Официальные оппоненты:

Егоров Сергей Николаевич доктор биологических наук, доцент, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, кафедра молекулярной биологии, доцент Ураков Валерий Николаевич кандидат биологических наук, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится «8» октября 2013 г. в 15.30 на заседании Совета Д 501.001.21 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория M-1.

Тел.8(495)939-54-83, эл. почта npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан «2» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. Пискункова Нина Федоровна.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Цефалоспорины – обширный класс антибиотиков с мощным бактерицидным действием, низкой токсичностью, широким терапевтическим диапазоном. Субстанцией для получения более наименований полусинтетических цефалоспоринов 5 поколений является природный беталактамный антибиотик цефалоспорин С (цефС), продуцируемый аскомицетом Aсremonium chrysogenum.

На протяжении последних тридцати лет был достигнут значительный прогресс в селекции промышленных штаммов – A. chrysogenum суперпродуцентов данного антибиотика, идентификации генов, контролирующих биосинтез цефС, и исследовании характера их регуляции.

Путь биосинтеза цефС хорошо изучен, насчитывает 6 ферментативных стадий, катализируемых продуктами генов «раннего» – pcbAB, pcbC, cefD1, cefD2 – и «позднего» – cefEF, cefG – кластеров биосинтеза антибиотика.

На внутриклеточном уровне биосинтез цефС строго компартментализован. Эффективность процессов внутриклеточного транспорта интермедиатов и экспорта цефС из клетки вносит существенный вклад в общий уровень продукции антибиотика, соотношение выхода конечного продукта и его промежуточных форм в процессе ферментации.

Гены мембранных транспортеров, вовлеченных в процессы транспорта цефС и его интермедиатов, являются перспективными мишенями для создания рекомбинантных штаммов с улучшенными A. chrysogenum производственными характеристиками. Особый интерес представляет белок СefT, относящийся к обширному классу MFS транспортеров. CefT осуществляет перенос бета-лактамов через плазматическую мембрану продуцента по принципу Н+-антипортера.

направленных на улучшение биосинтеза цефС, является Н+-АТФаза плазмалеммы PMA. Функцией белка является формирование на плазмалемме электрохимического градиента протонов, используемого для всех процессов транспорта метаболитов посредством Н+-симпортного, Н+-антипортного механизмов. Таким образом, H+-АТФаза должна играть существенную роль в энергообеспечении процессов синтеза и транспорта цефС.

Цель и задачи исследования Целью настоящей диссертационной работы является изучение роли предполагаемого транспортера цефалоспорина С СefT в регуляции продукции бета-лактамов у Acremonium chrysogenum.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

1. Определить хромосомную локализацию и характер экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С у высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D и штамма дикого типа АТСС 11550.

2. Cоздать системы экспрессии СefT из A. chrysogenum, PMA1 из Saccharomyces cerevisiae в виде их гибридов с флуоресцентными белками, изучить функциональную активность и субклеточную локализацию СefTTagCFP и PMA1-TagYFP в модельном объекте S. cerevisiae.

3. Cоздать системы экспрессии СefT-TagCFP и PMA1-TagYFP для A. chrysogenum, оптимизировать процедуру агробактериального переноса кассет экспрессии в штамм ВКМ F-4081D.

4. Получить рекомбинантные сеfT-клоны A. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Изучить влияние экспрессии CefT-TagCFP на биосинтез цефалоспорина С.

5. Получить рекомбинантные pma1-клоны A. chrysogenum ВКМ F-4081D, провести их молекулярно-генетическую характеристику. Исследовать функциональную активность PMA1-TagYFP, изучить влияние экспрессии PMA1 на биосинтез цефалоспорина С.

Научная новизна и практическая значимость работы В ходе работы был определен характер хромосомного полиморфизма и выявлены закономерности экспрессии генов биосинтеза и транспорта цефС для штаммов A. chrysogenum, различающихся в 100 раз и более по уровню продукции антибиотика. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах регуляции биосинтеза бета-лактамных промышленных штаммов A. chrysogenum, определяющих их способность к суперпродукции цефС.

Разработан подход для изучения функциональной активности и особенностей субклеточной локализации мембранного белка CefT в гетерологичной модельной системе S. сerevisiae. Метод универсален и может быть использован для структурно-функционального анализа других MFS транспортеров грибов, участвующих в процессах экспорта биологическиактивных вторичных метаболитов.

высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D методом агробактериального переноса (ATMT). С помощью ATMT впервые получены трансформанты высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D с конститутивной экспрессией функционально-активных гибридов мембранных транспортных белков CefT и PMA1 cлитых с флуоресцентными белками TagCFP, TagYFP.

высокопродуктивном штамме A. chrysogenum ВКМ F-4081D приводит к культуральной жидкости рекомбинантных штаммов интермедиатов биосинтеза цефалоспорина и снижению выхода конечного продукта, подтверждая тем самым данные о широкой субстратной специфичности CefT, установленные на модельной системе дрожжей-сахаромицетов.

В процессе экспериментальной работы были сконструированы новые универсальные экспрессионные вектора, позволяющие осуществлять агробактериальный перенос и конститутивную экспрессию целевых генов в клетках A. chrysogenum, а также других видов нитчатых грибов.

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Результаты работы получены лично автором или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены на нанобиотехнологии» (Москва, 2009 г); 14-ой, 15-ой, 16-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010, 2011, 2012 г); «5-ом Хорватском конгрессе по микробиологии с международным участием» (Примоштен, 2012 г), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ «Биологические механизмы» (СанктПетербург, 2013 г).

Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них в рецензируемых журналах – 2, в российских и иностранных журналах, входящих в перечень ВАК – 2, тезисы докладов на международных конференциях и семинарах – 2, тезисы докладов на российских научных конференциях – 6, получен 1 патент на изобретение РФ.

Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 139 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 10 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 221 ссылку, в том числе 214 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

A. chrysogenum высокопродуктивного ВКМ F-4081D A. chrysogenum привели к многократному повышению биосинтеза цефС: от 100 мг/л для штамма дикого типа АТСС 11550 до 25 г/л для современных промышленных продуцентов. При этом биохимические, физиологические и молекулярно-генетические отличия промышленных штаммов A. сhrysogenum, неизученными.

Сравнительная характеристика продуцентов A. сhrysogenum с различным уровнем антибиотикобразования (рис. 1 А, Б) – штамма дикого типа АТСС 11550 и высокопродуктивного штамма ВКМ F-4081D – в данной работе позволила выявить регуляторные изменения в штаммах, связанные с биосинтезом цефС, а также перспективные «мишени» для дальнейшего улучшения свойств продуцентов методами генетической инженерии.

Рисунок 1. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов A. chrysogenum. А – АТСС 11550; Б – ВКМ F-4081D. Стрелками указан пик, соответствующий времени выхода цефалоспорина С.

Важнейшими промышленными характеристиками высокопродуктивного штамма A. сhrysogenum ВКМ F-4081D, полученного многоступенчатым химическим мутагенезом являются: 1) полная прототрофность; 2) низкий уровень промежуточных форм метаболизма цефС (дезацетил- и дезацетоксипредшественников). A. сhrysogenum ВКМ F-4081D обладает рядом характерных физиологических и морфологических отличий от штамма дикого типа АТСС 11550 – замедление скорости роста, редукция воздушного микроморфологии и белковом составе клеточных стенок.

F-4081D и АТСС 11550 методом пульс-электрофореза в контролируемом гомогенном электрическом поле выявило различия между ними в размерах средних и легких хромосом: увеличение размера в области III-V хромосом, появление легкой хромосомы 2.1 м.п.н. Данный тип хромосомного полиморфизма у ВКМ F-4081D не связан с изменением локализации и копийности генов биосинтеза и транспорта цефС. Кластер «ранних генов»

локализован на хромосоме VI (4.4 м.п.н.), кластер «поздних генов» - на хромосоме II (2.3 м.п.н.) (рис. 2 А-Г). Оба кластера представлены в виде одной копии на геном A. chrysogenum ВКМ F-4081D по результатам ПЦР-РВ.

Рисунок 2. Молекулярное кариотипирование штаммов A. chrysogenum. А, В – электрофореграммы разделения хромосом A. chrysogenum. Дорожки: 1, 14 – S. cerevisiae YPH857; 2, 4, 6, 8, 10, 12 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D; 3, 5, 7, 9, 11, 13 – A. chrysogenum ATCC 11550. Б – Саузерн-гибридизация разделенных пульс-электрофорезом хромосом A. chrysogenum (рис. А) с зондом на ген cefT. Г – Саузерн-гибридизация разделенных пульс-электрофорезом хромосом A. chrysogenum (рис. В) с зондом на ген cefEF.

Стрелками обозначены хромосомы штаммов A. chrysogenum, с которыми гибридизуются пробы на «ранние» и «поздние» гены биосинтеза цефС.

Сравнение уровня транскрипции генов биосинтеза методом ПЦР-РВ увеличением экспрессии данных генов относительно штамма дикого типа АТСС 11550, также для ВКМ F-4081D изменена их временная динамика (рис. 3 А-Е).

Рисунок 3. Экспрессия генов биосинтеза в штаммах A. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). Нормализованная экспрессия pcbAB (А), pcbC (Б), cefD1 (В), cefD2 (Г), cefEF (Д), cefG (Е) в A. chrysogenum: 1–3 – ATCC 11550, 4–6 – ВКМ F-4081D.

Наиболее значительно различие в уровнях экспрессии «поздних» генов.

Уровень транскрипции cefEF в точках 48, 120 ч ферментации в штамме ВКМ F-4081D увеличен в 157-370 раз по отношению к штамму дикого типа ATCC 11550; cefG – в 23-82 раза.

транскрипции cefP в высокопродуктивном штамме снижен в 2-25 раз, cefM – увеличен в 6-23 раза в различных временных точках ферментации.

Экспрессия cefT в ВКМ F-4081D на начальных этапах культивирования выросла в 2-7 раз, однако в точке 120 ч штаммы не демонстрируют отличий в его экспрессии (рис. 4 А-В).

Рисунок 4. Экспрессия генов транспорта бета-лактамов в штаммах A. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). Нормализованная экспрессия cefP (А), cefM (Б), cefT (В) в A. chrysogenum: 1–3 – ATCC 11550, 4–6 – ВКМ F-4081D.

высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D и штамма дикого типа ATCC 11500 показал: увеличение продукции цефС связано не с изменениями хромосомной локализации и копийности генов биосинтеза бета-лактамов, а с увеличением в 2-370 раз их уровня транскрипции.

Создание систем экспрессии мембранных транспортеров СefTTagCFP, PMA1-TagYFP для модельного объекта S. сerevisiae функционирования исследуемых белков РMA1, СefT непосредственно на гетерогенность мицелия, низкая скорость роста продуцента, сложность получения мембранных фракций, неизученность генома A. сhrysogenum, др.

Перспективной альтернативой является использование дрожжейсахаромицетов как гетерологичного модельного объекта.

Для создания системы экспрессии РMA1-TagYFP в S. cerevisiae на основе центромерной плазмиды pYCp2HSE-PMA1 сконструировали вектор pZEN36, термоиндуцибельного HSE промотора (рис. 5 А).

функционально-активного гибрида СefT, слитого с флуоресцентным белком TagCFP, исследования характера его субклеточной локализации в клетке сахаромицетов была сконструирована панель эписомных и центромерных челночных векторов S. cerevisiae, несущих сплайсированную кДНК копию гена cefT-tagCFP под контролем термоиндуцибельного HSE (рис. 5 Б) или промоторов и типов экстрахромосомной дрожжевой ДНК в разработанных системах позволило существенно варьировать степень и временной характер экспрессии исследуемого гена.

Рисунок 5. Схемы кассет экспрессии pma1-tagYFP (А), cefT-tagCFP (Б).

Исследование субклеточной локализации PMA1-TagYFP, CefTTagCFP в модельном объекте S. cerevisiae мажорного белка дрожжевой мембраны РMA1 упростило задачу изучения особенностей локализации гетерологичного белка в S. cerevisiae.

В трансформантах штамма S. cerevisiae YPH857, полученных с помощью центромерного вектора pZEN35, содержащего ген cefT-tagCFP под контролем gpdA промотора, по данным флуоресцентной микроскопии, присутствовал сигнал TagCFP, локализованный в плазматической мембране.

Мембранная локализация исследуемого белка была подтверждена в опытах термоидуцибельного HSE промотора. Было показано, что значительная часть PMA1-TagYFP корректно локализуется в мембранных рафтах типа Р размером 40-70 нм, другая часть колокализована с CefT-TagCFP в областях плазмалеммы 200-1000 нм (рис. 6 А-Е).

Рисунок 6. Коэкспрессия CefT-TagCFP (из A. chrysogenum) и PMA1-TagYFP (из S. cerevisiae) в S. cerevisiae YPH857. Флуоресцентный анализ образцов S. cerevisiae YPH857_CefT-TagСFP/РMA1-TagYFP: А – фотография в проходящем свете (выделена зона дальнейших исследований); Б, В – флуоресцентный анализ S. cerevisiae YPH857_CefT-TagСFP(зеленый)/РMA1-TagYFP(красный), стрелками указаны зоны свечения; Г – фазовый контраст исследуемой области. Д – наложение структуры клетки в проходящем свете и флуоресценции CefT-TagСFP (рис. Г); Е – наложение структуры клетки в проходящем свете (рис. Г) и наложения флуоресценции CefT-TаgСFP и РMA1TagYFP (рис. Б, В).

Разработка системы функционального анализа белкатранспортера цефалоспорина С CefT-TagCFP в S. cerevisiae Транспортер MFS суперсемейства CefT A. chrysogenum является белком мультилекарственной устойчивости (MDR). В геноме S. cerevisiae S288C обнаружено 28 генов MDR-MFS белков (Nelissen et al., 1997), среди которых tpo1, tpo2, tpo3, qdr2, qdr3. Штаммы, мутантные по этим генам, отличаются повышенной чувствительностью к ряду токсичных соединений (Tomitori et al., 2001; Tenreiro et al., 2005; Uemura et al., 2005). С целью комплементации функции данных транспортеров исследуемым белком получили трансформанты серии S. cerevisiae BY4741MDR-MFS_CefTПри определении степени их чувствительности к ряду TagCFP.

предполагаемых субстратов выявили способность гетерологично экспрессируемого CefT-TagCFP к частичной комплементации функций MFS транспортеров Qdr3, Tpo3.

Трансформанты, полученные с использованием конструкции pZEN35d (промотор HSE), проявляли устойчивость к повышенным концентрациям спермидина (0.4 мМ), бромистого этидия (5 мкг/мл) по сравнению с конститутивного промотора TDH3 после трансформации вектором pZEN35e была токсична для клетки (рис. 7) и не обеспечивала формирования фенотипа устойчивости.

Рисунок 7. Анализ устойчивости штаммов S. cerevisiae, экспрессирующих CefTTagCFP к бромистому этидию. 1 – S. cerevisiae BY4741 ybr043c_pRS426 (К-); 2-4 – S. cerevisiae BY4741 ybr043c_HSE-CefT-TagCFP (индуцибельный промотор); 5-6 – S. cerevisiae BY4741 ybr043c_TDH3-CefT-TagCFP (конститутивный промотор); 7S. cerevisiae BY4741ypr156c_pRS426 (К-); 8-10 – S. cerevisiae BY4741ypr156c_HSECefT-TagCFP (индуцибельный промотор).

Совокупность полученных данных свидетельствует в пользу того, что сконструированный нами гибридный белок CefT-TagCFP проявляет свойства MFS MDR транспортера в дрожжевой клетке, а также сохраняет специфическую мембранную локализацию при гетерологичной экспрессии в S. cerevisiae.

Создание систем экспрессии мембранных транспортеров СefTTagCFP, PMA1-TagYFP для A. chrysogenum сконструирована на основе промотора гена глицеральдегид фосфат дегидрогеназы Aspergillus nidulans (gpdA), терминатора гена фосфоглицерат доминантного селективного маркера гена гигромицин-В фосфотрансферазы Escherichia coli (hph) под контролем промотора trpC A. nidulans.

Векторы для трансформации A. chrysognum pZEN31, pZEN33, pZEN36c были сконструированы на основе вектора TagCFP-N либо бинарного вектора pCAMBIA1300 (Hajdukiewicz et al., 1994) и содержали системы экспрессии гибридных белков cefТ-tagCFP; pma1-tagYFP (рис. 8 А-В).

Рисунок 8. Схемы кассет экспрессии cefT-tagCFP, pma1-tagYFP. А – pZEN31; Б – pZEN33; В – pZEN36с.

Получение рекомбинантных штаммов A. chrysogenum Первоначальный этап задачи получения рекомбинантных штаммов A. chrysogenum трансформации культуры.

Основной способ трансформации мицелиальных грибов в мировой практике – метод, основанный на получении протопластов. На данный момент для A. chrysogenum разработаны методики по протопластированию A. chrysogenum С10, др. Однако высокопродуктивные штаммы обладают рядом характерных физиологических и морфологических отличий, что усложняет решение проблемы трансформации и требует тщательной оптимизации методики.

Эффективной альтернативой выступила трансформация методом агропереноса, где донором для переноса экспрессионных кассет в клетки tumefaciens.

Для оптимизации АТМТ A. chrysogenum ВКМ F-4081D варьировали следующие параметры: генотип реципиентного штамма A. tumefaciens, состав сред для кокультивирования, длительность и температура процесса, тип используемых мембранных фильтров, тип кокультивируемых клеток (артроспоры, конидиоспоры, мицелий).

Трансформацию A. chrysogenum ВКМ F-4081D методом ATMT в оптимизированных условиях проводили путем кокультивирования препарата мицелия A. chrysogenum ВКМ F-4081D и клеток A. tumefaciens AGL0.

Совместную инкубацию суспензии мицелия продуцента и A. tumefaciens минимальной среде при низких оборотах с последующим высевом на селективные пластинчатые среды. Трансформационную смесь переносили на фильтры Hybond N на СМ-чашки, инкубировали в течение 2 суток при 250С в темноте.

высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D_Cef-TagCFP, 137 рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP.

Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum TagYFP Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP, A. chrysogenum отобранных на селективной среде с гигромицином В, проводили методом gpdA_F/AcrCefTEx1R, GKR1_N/GKF1_N, отсутствие плазмидной Npt3F/Npt3R и агробактериальной Vir1/Vir2 контаминации (рис. 9 А-Е).

Рисунок 9. Молекулярный анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum ВКМ F-4081D.

А, Г – ПЦР-анализ, подтверждающий присутствие последовательности гена tagCFP, tagYFP: 1-4 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP, 2-20 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP; 5, Mr – Mr (1 kb DNA ladder); 6, К- – A. chrysogenum ВКМ F-4081D; 7 – pZEN33; К+ – pZEN36с.

Б, Д – ПЦР-анализ, исключающий контаминацию последовательностями npt-гена: 1-4 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP, 2-20 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1TagYFP; 5, Mr – Mr (1 kb DNA ladder); 6, К- – A. chrysogenum ВКМ F-4081D, 7 – A. tumefaciens AGL0; 8 – pZEN33, К+ – pZEN36c.

В, Е – ПЦР-анализ, исключающий контаминацию последовательностями vir-генов A. tumefaciens: 1-4 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP, 2-20 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP; 5, Mr – Mr (1 kb DNA ladder); 6, К- – A. chrysogenum ВКМ F-4081D; 7, К+ – A. tumefaciens AGL0.

Хромосомная интеграция кассет экспрессии для отобранных по результатам ПЦР клонов была доказана методом Саузерн-гибридизации (рис. 10 А-Б) с зондом на меченый альфа-P32dATP ПЦР-фрагмент, соответствующий последовательностям tagCFP, tagYFP (рис. 10 А-Б).

Рекомбинантные клоны A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP, A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP отобрали для последующего изучения роли исследуемых белков в регуляции продукции цефС в высокоактивном штамме A. chrysogenum ВКМ F-4081D.

Рисунок 10. Саузерн-блот анализ рекомбинантных клонов A. chrysogenum. А – ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP: 1 – 1 kb DNA ladder, 2-7 – рестрикция ДНК AgeI: 2 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D; 3 – pZEN33; 4 – A. chrysogenum АТСС 11550, 5-7 – A. chrysogenum ВКМ F-4081DСefT-TagCFP. Б – ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP: 1-3, 5- – рестрикция ДНК AsiAI, 4 – 1 kb DNA ladder, 1, 2 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D, 3 – pZEN36c, 5-10 – A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP.

Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера PMA1-TagYFP в регуляции продукции цефалоспорина С Изучение экспрессии эндогенного pma в контрольных штаммах A. chrysogenum АТСС 11550 и ВКМ F-4081D методом ПЦР-РВ показало однонаправленную динамику: уровень экспрессии гена закономерно возрастал на протяжении культивирования (рис. 11 А). При этом экспрессия pma для штамма дикого типа была существенно выше, чем для высокопродуктивного ВКМ F-4081D: в 11-12 раз на стадии посевной культуры, в 2-3 раза на стадии ферментации. Обнаруженная дефектность высокопродуктивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D по синтезу H+-АТФазы была скорректирована в pma1-клонах, где наблюдали рост экспрессии эндогенного рma (рис. 11 А).

Конститутивную экспрессию гетерологичной H+-АТФазы PMA1 в А. chrysogenum ВКМ F-4081D осуществляли в виде ее N-концевого гибрида c рекомбинантных клонах подтвердили ПЦР-РВ с селективными праймерами на негомологичную зону гетерологичного pma1 (рис. 11 Б).

Рисунок 11. Экспрессия pma, pma1 в штаммах A. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). А – нормализованная экспрессия pma в A. chrysogenum: 1–3 – ATCC 11550, 4– – ВКМ F-4081D, 7–9 – ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP; Б – нормализованная экспрессия pma1 в A. chrysogenum: 1–3 – ВКМ F-4081D, 4–6 – ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP.

клонах A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP показала локализацию гетерологичной H+-AТФазы в плазматической мембране продуцента (рис. А-В).

Рисунок 12. Экспрессия PMA1-TagYFP (из S. cerevisiae) в A. chrysogenum ВКМ F-4081D. А – фотография в проходящем свете; Б, В – флуоресцентный анализ A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP (зеленый). В – наложение структуры клетки в проходящем свете (рис. А) и флуоресценции PMA1-TagYFP (рис. Б).

Для полученных клонов было выявлено существенное снижение внутриклеточного содержания АТФ в 1.5-2.0 раза по отношению к контрольному штамму ВКМ F-4081D, что свидетельствует о его активном гидролизе при дополнительной экспрессии H+-АТФазы.

A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP показал снижение уровня биосинтеза цефС относительно контрольного штамма (рис. 13 А-В, табл. 1).

Рисунок 13. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов A. chrysogenum. А – ВКМ F-4081D; Б, В – ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP. Стрелками указан пик, соответствующий времени выхода цефалоспорина С.

Таблица 1. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP.

Сравнительный анализ уровня транскрипции генов биосинтетических кластеров цефалоспорина в A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP и контрольном штамме показал, что для низкоактивного клона с уровнем высокоактивного клона с биосинтезом цефС 3815 мг/л наблюдается колебание экспрессии относительно контрольного уровня A. chrysogenum ВКМ F-4081D. В анализируемых клонах уровни биосинтеза цефС и транскрипции pcbAB, pcbC, cefEF, cefG коррелировали: для клона с продукцией 3815 мг/л их экспрессия увеличена в 2-5 раз по сравнению с клоном с уровнем биосинтеза 1222 мг/л.

Анализ A. chrysogenum ВКМ F-4081D_PMA1-TagYFP показал, что повышенная экспрессия Н+-АТФазы обладает в целом негативным эффектом на продукцию цефС, который обусловлен снижением необходимого уровня внутриклеточного АТФ, дополнительно расходуемого на работу гетерологичной Н+-АТФазы, и изменением временной динамики и уровня транскрипции генов биосинтетических кластеров.

Метаболическая инженерия A. chrysogenum: роль мембранного транспортера CefT-TagCFP в регуляции продукции цефалоспорина С Исследование уровня экспрессии сefT в A. chrysogenum АТСС 11550 и ВКМ F-4081D показало возрастающую динамику для штаммов в процессе культивирования. Уровень транскрипции cefT для ВКМ F-4081D на начальных этапах ферментации увеличен в 2-7 раз, однако в точке 120 ч штаммы не демонстрируют отличий в его транскрипции (рис. 14 А).

Анализ экспрессии cefT в клонах A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefTTagCFP показал увеличение уровня транскрипции гена в 2–8 раз по сравнению с контрольным штаммом ВКМ F-4081D (рис. 14 А). Суммарный прирост экспрессии cefT в рекомбинантных клонах подтвердили анализом уровня транскрипции гена гибридного белка cefT-tagCFP с праймерами на 3’концевую зону cefT и 5’-зону tagCFP (рис. 14 Б).

Рисунок 14. Экспрессия cefT, cefT-tagCFP в штаммах A. chrysogenum в точках 0 (I), 48 (II), 120 ч (III). А – нормализованная экспрессия cefT в A. chrysogenum: 1–3 – ATCC 11550, 4–6 – ВКМ F-4081D, 7–9 – ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP; Б – нормализованная экспрессия cefT-tagCFP в A. chrysogenum: 1–3 – ВКМ F-4081D, 4–6 – ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP.

ВЭЖХ-анализ A. chrysogenum ВКМ F-4081D_CefT-TagCFP показал снижение уровня синтеза целевого метаболита цефалоспорина С до 7 % по сравнению с исходным штаммом. Данный эффект сопряжен с ростом содержания в культуральной жидкости предшественников цефС – дезацетил, дезацетоксицефалоспорина С на 5-7 % и сохранением, таким образом, общего баланса бета-лактамов (рис. 15 А-Г).

Рисунок 15. ВЭЖХ-анализ супернатантов культуральной жидкости штаммов A. chrysogenum ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP. 1 – дезацетилцефалоспорин С, 2 – дезацетоксицефалоспорин С, 3 – цефалоспорин С. A. chrysogenum: А – ВКМ F_4081D, Б–Г – ВКМ F-4081D_СefT-TagCFP.

ПЦР-РВ показал изменение профиля и уровня транскрипции генов F-4081D_CefT-TagCFP относительно контрольного штамма ВКМ F-4081D.

Эффект незначительного снижения транспорта цефС и повышения секреции промежуточных форм его биосинтеза говорят о невысокой субстратной специфичности транспортера СefT, что характерно для МFSMDR белков. При конститутивной экспрессии cefT наблюдали повышение проницаемости мембраны и увеличение транспорта интермедиатов цефалоспорина, что приводило к снижению их внутриклеточного пула.

Эти данные, а также результаты исследования активности СefT в гетерологичной системе дрожжей-сахаромицетов свидетельствуют в пользу способности изучаемого белка осуществлять экспорт структурнородственных -лактамов, а также полиаминов, бромистого этидия, органических кислот, и, видимо, целого ряда других соединений. Различия в эффектах повышенной экспрессии СefT, оказываемой на биосинтез цефалоспорина С для штамма дикого типа, умеренных продуцентов и полученных нами результатов для высокоактивного штамма, соответствуют современным представлениям о характере регуляции процессов биосинтеза и транспорта цефС в ходе антибиотикообразования у A. chrysogenum.

ВЫВОДЫ

1. Хромосомный полиморфизм у высокоактивного штамма A. chrysogenum ВКМ F-4081D не связан с изменением локализации и копийности генов биосинтеза и транспорта цефалоспорина С.

2. Уровень транскрипции генов биосинтеза цефалоспорина С для A. chrysogenum ВКМ F-4081D повышен в 2-370 раз относительно штамма дикого типа A. chrysogenum АТСС 11550.

3. Транспортный белок СefT-TagCFP при экспрессии в модельной системе S. cerevisiae локализуется в районах плазмалеммы диаметром 200-1000 нм транспортеров сахаромицетов.

4. Оптимизирован метод агробактериальной трансформации в A. chrysogenum и PMA1-TagYFP из S. cerevisiae.

5. PMA1-TagYFP локализуется в плазматической мембране A. chrysogenum ВКМ F-4081D, повышение уровня экспрессии PMA1 в трансформантах негативно коррелирует с уровнями внутриклеточного АТФ и продукцией цефалоспорина С.

6. Конститутивная экспрессия CefT-TagCFP в A. chrysogenum ВКМ F-4081D приводит к увеличению экспорта интермедиатов цефалоспорина С при сохранении базового уровня продукции бета-лактамов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, опубликованы 2 статьи по материалам диссертации:

Думина М.В., Жгун А.А., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А.

Хромосомный полиморфизм штаммов Acremonium chrysogenum – продуцентов цефалоспорина С // Генетика. 2012. Т.48. №8. С. 918 – 926.

Думина М.В., Жгун А.А., Керпичников И.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Валиахметов А.Я., Кнорре Д.А., Северин Ф.Ф., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э. Функциональная характеристика MFS транспортера беталактамных антибиотиков CefT в Acremonium chrysogenum и Saccharomyces cerevisiae // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т.49. № 4, с. 372 – 381.

Получен 1 патент РФ:

Жгун А.А., Носков В.В., Керпичников И.В., Эльдаров М.А., Думина М.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pZEN16 для переноса и экспрессии генов в мицелиальном грибе Acremonium chrysogenum // Патент РФ № 2434944 от 27.11.2011.

Опубликовано 8 тезисов докладов на российских и международных конференциях:

Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э., Жгун А.А. Разработка подходов для получения рекомбинантных штаммов Acremonium chrysogenum с повышенной экспрессией гена мембранного транспортера цефалоспорина С CefT // нанобиотехнологии». Звенигород, 2009. С. 33-34.

Жгун А.А., Бартошевич Ю.Э., Домрачева А.Г., Новак М.И., Чумаленко Н.Л., Думина М.В., Керпичников И.В., Носков В.Н., Эльдаров М.А. Изучение молекулярного контроля биосинтеза цефалоспорина С в мицелиальном грибе Acremonium chrysogenum // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы». Москва, 2009. С. 18.

Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Валиахметов А.Я., Жгун А.А. Мембранная топология транспортера цефалоспорина С (CefT) из Acremonium chrysogenum в клетках S.cerevisiae, слитого с циановым флуоресцентным белком // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2010. С. 131.

Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Валиахметов А.Я., Жгун А.А. Исследование функциональной активности MFS транспортера из штамма продуцента цефалоспорина С Acremonium chrysogenum // 15-ая Международная Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2011.

С. 290.

Думина М.В., Домрачева А.Г., Новак М.И., Бартошевич Ю.Э., Эльдаров М.А., Жгун А.А. Исследование хромосомного полиморфизма штаммов Acremonium chrysogenum // 15-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2011. С. 31.

Думина М.В., Жгун А.А, Валиахметов А.Я., Домрачева А.Г., Новак М.И., Эльдаров М.А., Бартошевич Ю.Э. Конститутивная экспрессия H+АТФазы S. сеrevisiae в штамме Aсremonium chrysogenum - продуценте цефалоспорина С: влияние на выход цефалоспорина и его интермедиатов, биохимические и физиологические эффекты // 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века». Пущино, 2012. С. 254.

7. Maria Dumina, Alexander Zhgoun, Marina Novak, Alla Domratcheva, Mikhail Eldarov, Yuri Bartoshevitch. Comparative analysis of expression levels of cephalosporin C biosynthesis and transport genes in laboratory and industrial strains of Acremonium chrysogenum // 5-th Croatian Congress of Microbiology.

Primoshten, 2012. P. 58.

8. M. Dumina, A. Zhgun, A. Domratcheva, M. Novak, D. Knorre, F. Severin, M. Eldarov, Y. Bartoshevitch. Metabolic engineering of cephalosporin C producer – Acremonium chrysogenum: overexpression of MFS transporter CefT changes biosynthesis profile of beta-lactam compounds // Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 «Mechanisms in Biology», 2013. P. 611.



Похожие работы:

«Бондарева Вероника Викторовна СОРБЦИОННОЕ ИЗВЛЕЧЕНИЕ ПАЛЛАДИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИМИ ВОЛОКНИСТЫМИ ИОНИТАМИ 05.17.02 технология редких, рассеянных и радиоактивных элементов Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева Научный руководитель : доктор технических наук, старший научный сотрудник Трошкина Ирина Дмитриевна Официальные оппоненты :...»

«ВЛАСОВА Елена Юрьевна ПРОФИЛАКТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ ИЗ ГРУПП ПОВЫШЕННОГО РИСКА ЗАБОЛЕВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ СРЕДСТВ 14.00.09 – педиатрия 14.00.26 – фтизиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2009 Диссертация выполнена на кафедре фтизиатрии и на кафедре реабилитологии факультета повышения квалификации и последипломной подготовки Государственного образовательного учреждения высшего...»

«ЗОРЬКИН Виталий Евгеньевич ЕЖЕГОДНЫЕ ПОСЛАНИЯ ФЕДЕРАЛЬНОМУ СОБРАНИЮ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК СРЕДСТВО ФОРМИРОВАНИЯ И РЕАЛИЗАЦИИ ПРАВОВОЙ ПОЛИТИКИ ПРЕЗИДЕНТА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 12.00.01 – теория и история права и государства; история учений о праве и государстве АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата юридических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена на кафедре теории и истории государства и права НОУ ВПО Юридический институт...»

«Ковальчук Лидия Петровна КОНЦЕПТУАЛЬНАЯ ИНТЕГРАЦИЯ ИСХОДНОГО ПРОСТРАНСТВА ЖЕНЩИНА В СКАЗОЧНОМ ДИСКУРСЕ (на материале русских и английских народных сказок) Специальность 10.02.20 – Сравнительно-историческое, типологическое и сопоставительное языкознание АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Челябинск – 2012 Работа выполнена на кафедре теории и практики английского языка ФГБОУ ВПО Челябинский государственный университет кандидат...»

«ВАСИЛЬЕВА Наталья Анатольевна СТАНОВЛЕНИЕ ЕСТЕСТВЕННОНАУЧНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В РОССИИ В XVIII – ПЕРВОЙ ПОЛОВИНЕ XIX ВВ. (ДО РЕФОРМ 60-х гг.) 13.00.01 – общая педагогика, история педагогики и образования АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск - 2008 2 Работа выполнена на кафедре педагогики государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижнетагильская государственная социально-педагогическая...»

«КУДИНОВ Владимир Валерьевич ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ КАК СРЕДСТВО РЕАЛИЗАЦИИ ЭМПИРИЧЕСКОГО ПОЗНАНИЯ ПРИ ОБУЧЕНИИ ФИЗИКЕ В 5-6 КЛАССАХ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (физика, уровень общего образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск – 2011 Работа выполнена на кафедре теории и методики обучения физике ФГБОУ ВПО Челябинский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор...»

«Поливникова Ольга Валентиновна УДК.621.385.7 ИССЛЕДОВАНИЕ И РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНЫХ МАГНЕТРОННЫХ КАТОДОВ НА ПРИНЦИПЕ ПЕРЕНОСА АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА ИЗ НЕЗАВИСИМОГО ИСТОЧНИКА НА ЭМИТИРУЮЩУЮ ПОВЕРХНОСТЬ ЧЕРЕЗ ВАКУУМ Специальность 05.27.02 Вакуумная и плазменная электроника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Фрязино, 2006 г. 2 Работа выполнена на Федеральном Государственном Унитарном Предприятии Научно-производственное предприятие Исток...»

«ТУНИК ГАЛИНА АЛЕКСАНДРОВНА СОВРЕМЕННАЯ РОССИЙСКАЯ ГЕРАЛЬДИКА КАК ФАКТОР ОТРАЖЕНИЯ СПЕЦИФИКИ РОССИЙСКОГО ГОСУДАРСТВА: ИСТОРИКО-ПОЛИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Специальность 23.00.02 - политические институты, этнополитическая конфликтология, национальные и политические процессы и технологии АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора политических наук Москва 2008 2 Диссертационная работа выполнена на кафедре национальных и федеративных отношений ФГОУ ВПО Российская...»

«ТОЛПЫГИН АЛЕКСЕЙ ОЛЕГОВИЧ КОМПЛЕКСЫ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ С ПОЛИДЕНТАТНЫМИ БИС(АМИДИНАТНЫМИ) ЛИГАНДАМИ 02.00.08 – химия элементоорганических соединений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте...»

«Попова Мария Вячеславовна РАЗРАБОТКА И ОБОСНОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ТОКООГРАНИЧИВАЮЩЕГО УСТРОЙСТВА ДЛЯ СИСТЕМ СЕЛЬСКОГО ЭЛЕКТРОСНАБЖЕНИЯ Специальность 05.20.02 – Электротехнологии и электрооборудование в сельском хозяйстве Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Российский Государственный аграрный заочный...»

«ВОЛКОВ Владимир Николаевич ПРОТОТИП ЭЛЕКТРОННОГО ФОТОКАТОДНОГО ВЧ ИНЖЕКТОРА СО СВЕРХПРОВОДЯЩИМ РЕЗОНАТОРОМ 01.04.20 - физика пучков заряженных частиц и ускорительная техника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук НОВОСИБИРСК – 2007 1 Работа выполнена в Институте ядерной физики им. Г.И.Будкера СО РАН. НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Петров кандидат технических наук, – Виктор Михайлович Институт ядерной физики им. Г.И. Будкера, СО РАН, г....»

«Алексеева Екатерина Николаевна ТРАНСНАЦИОНАЛЬНАЯ МИГРАЦИЯ МОЛОДЕЖИ И ЕЕ СОЦИАЛЬНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ В СОВРЕМЕННОМ МИРЕ Специальность 22.00.04 – Социальная структура, социальные институты и процессы Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата социологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре истории и теории социологии социологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Димитриев Юрий Олегович СОВРЕМЕННОЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ФЛОРЫ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА УЛЬЯНОВСКА) 03.02.01 – Ботаника 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова кандидат биологических наук, доцент Научный руководитель : Масленников Андрей...»

«ЧЕРНЯК Кирилл Григорьевич ОРИЕНТАЦИЯ И СТРУКТУРА СЕГНЕТОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ СМЕКТИКОВ С* ВО ВНЕШНЕМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОМ ПОЛЕ Специальность 01.04.02 теоретическая физика Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Санкт-Петербург 2010 год Работа выполнена на кафедре статистической физики физического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор...»

«Тормашев Дмитрий Сергеевич ОЦЕНКА ТЕХНИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ НАДЕЖНОСТИ НАСОСОВ СИСТЕМ СУДОВЫХ ДИЗЕЛЕЙ Специальность: 05.08.05 – Судовые энергетические установки и их элементы (главные и вспомогательные) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Новороссийск – 2012 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Морская государственная академия имени адмирала Ф.Ф. Ушакова Научный руководитель : доктор технических наук, профессор,...»

«ПОЛЕЦ Анастасия Юрьевна ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕКТОНИЧЕСКИХ НАПРЯЖЕНИЙ И ГЛУБИННОЙ СЕЙСМОТЕКТОНИКИ ЮЖНОЙ И ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ КУРИЛООХОТСКОГО РЕГИОНА Специальность 25.00.10 – геофизика, геофизические методы поисков полезных ископаемых АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Наук Институт морской геологии и геофизики ДВО РАН (ИМГиГ ДВО РАН) и ГОУ ВПО Сахалинский...»

«КНЯЗЬКОВ Дмитрий Юрьевич МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ ГОЛОГРАФИЧЕСКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТИВНЫХ МЕТОДОВ РАСЧЕТА ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ специальность 05.13.18 — Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук Москва — 2013 Работа выполнена в лаборатории механики управляемых систем Федерального государственного бюджетного учреждении науки...»

«ПАРАСКЕВОВА ДИНА ВЛАДИМИРОВНА ПРИЗНАНИЕ СДЕЛКИ НЕДЕЙСТВИТЕЛЬНОЙ И(ИЛИ) ПРИМЕНЕНИЕ ПОСЛЕДСТВИЙ НЕДЕЙСТВИТЕЛЬНОСТИ СДЕЛКИ КАК СПОСОБЫ ЗАЩИТЫ ГРАЖДАНСКИХ ПРАВ Специальность 12.00.03 – гражданское право; предпринимательское право; семейное право; международное частное право АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата юридических наук Краснодар 2010 Диссертация выполнена на кафедре гражданского права ГОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет...»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»

«НГУЕН ВИНЬ ТИЕН КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В СИСТЕМЕ СУБСТРАТ – БИОКАТАЛИЗАТОР – МЕДИАТОР – ЭЛЕКТРОД В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ НА ОСНОВЕ GLUCONOBACTER OXYDANS 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2013 Работа выполнена кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент,...»




























 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.