WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА РАН

на правах рукописи

ТКАЧУК АРТЕМ ПЕТРОВИЧ

РАЗРАБОТКА МЕТОДА СТАБИЛИЗАЦИИ ТРАНСГЕНОВ ПОСЛЕ ИХ

ИНТЕГРАЦИИ В ГЕНОМ

Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010  

Работа выполнена в группе биологии теломер Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Савицкий Михаил Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Любомирская Наталия Вениаминовна доктор биологических наук Краснов Алексей Николаевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится 23 декабря 2010 года в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан ноября 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, канд. фарм. наук Грабовская Л.С.

  2     

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последние успехи в области генетического определения пола насекомых и интенсивная работа над созданием трансгенных комаров, не способных переносить малярию или лихорадку Денге, говорят о том, что внедрение и широкое использование эффективных программ контроля численности вредителей и контроля над трансмиссивными заболеваниями с помощью трансгенных насекомых дело ближайшего будущего.

Основным методом получения трансгенных насекомых является интеграция в геном реципиента генетического материала с помощью неавтономных транспозонов, которые представляют собой векторную молекулу, содержащую концевые инвертированные повторы (TIR от англ. - terminal inverted repeats) транспозона, между которыми заключена последовательность трансгена. При таком способе интеграции трансген оказывается окруженным TIR мобильного элемента. Оба повтора необходимы для перемещения транспозона и узнаются транспозазой, которая вырезает фланкированную ими последовательность из одного места в геноме и вставляет ее в другое (“cut and paste” механизм).

При внедрении в природную популяцию насекомых-вредителей большого числа трансгенных насекомых основной задачей, стоящей перед специалистами, является соблюдение высокого уровня безопасности технологии для человека и окружающей среды.

Одним из главных рисков при использовании трансгенных насекомых в программах контроля численности насекомых-вредителей или при замещении дикой популяции переносчиков малярии или лихорадки Денге резистентными трансгенными насекомыми является возможность ремобилизации трансгена. При внешнем источнике транспозазы трансген ремобилизуется и начнет перемещаться по геному. Как поведет себя тот или иной трансген, предсказать невозможно. Риск повышает и то, что горизонтальный перенос транспозона и последующее его распространение в популяции могут происходить с большой скоростью. Кроме того, многие родственные семейства транспозонов способны к перекрестной мобилизации, т. е. транспозаза одного типа мобильных элементов может вызывать транспозиции другого транспозона.

Существующая сейчас технология получения трансгенных насекомых не соответствует этому требованию. Все методы, предложенные для постинтеграционной стабилизации трансгенов, основаны на одной и той же идее: ввести в конструкцию дополнительный сайт для узнавания транспозазой (TIR одного из транспозонов).

Встраиваться и перемещаться при наличии источника транспозазы способна как полноразмерная конструкция, так и маленький трансген в ее составе, окруженный TIR. Если в геном встроилась полноразмерная конструкция, а после ремобилизации вырезалась только ее часть, то в геноме останется трансген с единственным TIR. Такой трансген уже не способен перемещаться. Однако методы стабилизации трансгенов, основанные на этом принципе, низкоэффективны, сложны и часто не позволяют удалить оба плеча транспозона.

Кроме того, использование стадий искусственной дестабилизации генома в процессе получения стабилизированных трансгенов может быть потенциально опасным.

В связи с этим актуальной задачей становится разработка метода стабилизации трансгенов после их интеграции в геном.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было разработать метод стабилизации трансгенов после их интеграции в геном на базе репарации индуцированных двуцепочечных разрывов ДНК.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новый метод стабилизации трансгенов после их сайт-неспецифической интеграции в геном на основе репарации индуцированных двуцепочечных разрывов ДНК в модельной системе Drosophila melanogaster 2. Выявить эффективный механизм репарации двуцепочечных разрывов ДНК для реализации разработанного метода стабилизации трансгенов 3. Проанализировать характер делеций генетического материала, возникающих в результате репарации индуцированных двуцепочечных разрывов 4. Разработать новый метод стабилизации трансгенов после их сайт-специфической интеграции в геном за счет SSA репарации индуцированных двуцепочечных разрывов ДНК в модельной системе D. melanogaster 5. Показать возможность эффективного одновременного удаления обоих плечей неавтономного транспозона и селективных маркеров Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе предложен принципиально новый эффективный метод стабилизации трансгена после его интеграции в геном реципиента. Метод основан на индукции двуцепочечных разрывов ДНК и их последующей репарации, за счет которой происходит удаление плечей транспозона.



Впервые показана возможность стабилизации трансгенов за счет удаления обоих плечей транспозона без использования транспозазы. Выявлен размер делеций, возникающих в результате NHEJ-репарации индуцированных двуцепочечных разрывов.

Предложенные схемы строения векторных молекул могут быть использованы при создании удобных векторов для трансгенеза насекомых в интегрированных программах контроля численности вредителей (IPM program – от англ. Integrated pest management program). Кроме того, универсальность используемых принципов стабилизации трансгенов, позволит создать серию универсальных векторов для трансгенеза животных, растений и клеточных линий со стабилизированными трансгенами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 12-й и 14-й международных конференциях молодых ученых «Биологиянаука XXI века» (Пущино, 2008, 2010, соотв. Лауреат конкурса на лучшую научную работу), на Международной выставке-конференции «РосБиоТех-2008» в рамках молодежного научно-инновационного форума «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2008. Лауреат конкурса на лучшую инновационную разработку), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010»

(Москва, 2010. Лучший доклад конференции) и на межлабораторном семинаре ИБГ РАН (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ. Из них статья в рецензируемом журнале и 4 тезисов докладов и материалов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах, включает таблиц и _ рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего _ источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка метода для сайт-неспецифической интеграции и стабилизации 1.1 Выбор эффективного механизма репарации двуцепочечных разрывов ДНК в качестве основного инструмента метода Репарация двуцепочечных разрывов ДНК в отсутствие гомологичной матрицы, по которой возможна точная репарация, часто происходит с потерей части генетического материала. Если двуцепочечный разрыв происходит между двумя сонаправленными повторяющимися участками генома, то одним из вариантов репарации такого разрыва является SSA (от англ. single strand anneling – отжиг одиночной цепи) механизм.

Отличительная особенность этого типа репарации – потеря одного из повторов и участка генома между ними (далее – «спейсер»).

Вторым путем репарации двуцепочечного разрыва, даже произошедшего в контексте сонаправленных повторов, является механизм NHEJ (от англ. Non-homologous end joining – негомологичное соединение концов). Репарация двуцепочечных разрывов ДНК по NHEJ механизму часто сопровождается делециями генетического материала. Таким образом, если расположить точку внесения разрыва рядом со спейсером, то репарация возникшего разрыва по механизму NHEJ может привести к его делеции.

Для транспозиции мобильного элемента необходима не вся последовательность 5’ и 3’ плеч мобильного элемента. Выделяют несколько функциональных участков длиной 10- п.н., без которых перемещение транспозона невозможно.

Мы предположили, что если дуплицировать небольшой участок плеча транспозона, а его функциональный участок разместить в спейсере, то после внесения двуцепочечного разрыва между копиями, транспозон потеряет способность к перемещению из-за потери функциональной части плеча. Данный механизм будет работать как в случае репарации двуцепочечного разрыва ДНК по SSA механизму (потеря спейсера и одного из повторов вследствие комплиментарного отжига цепей двух сонаправленных повторов), так и в случае NHEJ репарации (делеция спейсера в результате прямого соединения разорванных концов ДНК на основе поиска случайных микрогомологичных участков).

Для проверки выдвинутой гипотезы нами была создана векторная генетическая конструкция CTS (от англ. Casper Transgene Stability). При создании CTS за основу была взята коммерчески доступная векторная генетическая конструкция CaSpeR 4.

Этот вектор содержит плечи P-элемента - мобильного генетического элемента, впервые обнаруженного у D. melanogaster. CaSpeR 4 широко используется для трансформации D. melanogaster, позволяет быстро провести селекцию трансформантов.

В качестве трансгена, подлежащего стабилизации, мы выбрали ген white (W), который содержится в CaSpeR 4. Данный ген отвечает за окраску глаз мухи, легко детектируется, поэтому часто используется в работах по трансгенезу у D. melanogaster в качестве маркерного.  Для того, чтобы индуцировать SSA репарацию двуцепочечного разрыва ДНК мы дуплицировали 3’TIR P-элемента и поместили его между геном white и 3’ плечом транспозона (последовательность 3’miniP). Если бы разрыв, произведенный между сонаправленными копиями TIR транспозона, репарировался по SSA механизму, то последовательность 3’ плеча мобильного элемента должна была быть удалена, а в геноме остался только 3’TIR. Из литературных данных известно, что при длине 3’ плеча транспозона менее 126 п.н., транспозаза не способна узнать специфическую последовательность TIR и перемещение транспозона в этом случае не происходит.

Для того чтобы индуцировать процесс репарации в геноме необходимо искусственно вызвать двуцепочечный разрыв ДНК в заданном месте. Этого можно добиться, используя сайт-специфические мегануклеазы с длинными сайтами узнавания. Данный класс эндонуклеаз рестрикции имеет протяженные уникальные сайты узнавания (от 12 до 45 п.н.), поэтому вероятность встречи, например, 18 членного сайта мегануклеазы I-SceI в геноме равна 7x10-10, что на порядок больше, чем геном человека (~3x109 п.н.). Геном Drosophila не содержит сайтов узнавания для I-SceI, что делает рестриктазу удобным инструментом для манипуляций с трансгеном in vivo, в частности для изучения репарации, поскольку позволяет индуцировать разрыв в конкретном месте.

Для детекции перестроек генома в процессе репарации между функциональным полноразмерным 3’-концом транспозона и его сонаправленной укороченной копией мы поместили ген EGFP(G) под контролем тканеспецифического искусственного промотора 3xP3, который обеспечивает экспрессию маркерного белка только в глазах насекомого. Ген маркерного белка мы окружили сайтами I-SceI. Таким образом, нами была создана конструкция следующего строения: 5’TIR–white–I-SceI–EGFP–I-SceI– 3’TIR.

трансформированы 150 эмбрионов D. melanogaster линии y1w1118. Отбор трансформантов проводился визуально по окраске глаз. Благодаря наличию в трансгене гена white, трансформанты имели оранжевую окраску глаз. Также, используя флуоресцентный стереомикроскоп, нами контролировалась экспрессия EGFP.

Были получены 11 линий трансформантов. Самцы полученных линий скрещивались с самками, несущими трансген с I-SceI под контролем промотора гена теплового шока.

Потомки этих мух (F1) подвергались тепловому шоку на ранних стадиях развития, что индуцировало синтез рестриктазы. Мухи из F1 скрещивались с мухами линии y1w1118 и уже в F2 мы наблюдали потерю маркерного гена EGFP, которая в среднем составляла 52%. Схема проведения эксперимента отражена на рисунке 1.

В дальнейшей работе мы использовали две линии мух – CTS2 и CTS8, с трансгенами на 2R и 2L хромосомах, соответственно. Для них методом инвертированной ПЦР были установлены точные места встроек трансгена в геном. Нами было проанализировано по мух – потомков CTS2 и CTS8, потерявших EGFP. Эти мухи должны были нести трансген с делецией между сайтами I-SceI, образовавшейся в результате индукции разрывов по ним и последующей репарации. Нас интересовал вопрос, как разрывы вблизи 3’TIR повлияли на его целостность. Мы использовали праймеры из мест инсерции в геном и праймер из последовательности трансгена. Основной задачей эксперимента было найти трансген c делецией 3’TIR P-элемента, которая могла возникнуть в результате репарации двуцепочечного разрыва. Ампликоны до 500 п.н. для линии CTS2 и до 350 п.н. для CTS свидетельствовали о наличии значимой делеции в районе 3’плеча транспозона и секвенировались. В линии CTS2 нами была найдена муха, репарация у которой прошла с делецией 405 п.н. В результате делеции 3’-конец мобильного элемента был полностью удален, а, следовательно, конструкция была полностью стабилизирована. В выборке из линии CTS8 также была обнаружена муха с 240 п.н. делецией. Секвенирование показало, что в этом случае 3’плечо транспозона было сильно нарушено. От него осталась только последовательность длиной 51 п.н., то есть он потерял около 80% своей последовательности.

Учитывая то, что при длине плеча менее 126 п.н. транспозон полностью теряет способность к перемещению, транспозон с оставшейся 51 п.н. последовательностью 3’плеча можно считать неспособным к перемещению.

ПЦР анализ ДНК трансгенных насекомых, у которых произошла репарация индуцированного двуцепочечного разрыва, не выявил продуктов SSA репарации. Эти данные свидетельствуют о том, что контекст вносимого двуцепочечного разрыва в конструкции созданного вектора не отвечает минимальным требованиям, необходимым для эффективного прохождения репарации разрыва по механизму SSA. Наиболее важными условиями SSA репарации двуцепочечного разрыва ДНК является длина сонаправленных повторов, окружающих разрыв, и размер спейсерных участков. Чем больше длина повтора и меньше спейсер, тем эффективней разрыв репарируется с помощью SSA механизма. Так как в векторе CTS длина небольших сонаправленных повторов (31 п.н.) соразмерна с длиной спейсера – 25 п.н., это привело к резкому снижению эффективности SSA репарации двуцепочечного разрыва ДНК. Поскольку увеличение длины сонаправленных повторов свыше 100 п.н. невозможно из-за риска ремобилизации трансгена, мы отказались от идеи сайт-направленной делеции функциональной части плеча неавтономного мобильного элемента с помощью механизма SSA репарации.

Тем не менее, успешное удаление функциональной части плеча неавтономного транспозона с помощью репарации двуцепочечных разрывов ДНК по NHEJ - механизму доказало принципиальную возможность стабилизации трансгенов после их интеграции в геном.

1.2 NHEJ репарация двуцепочечных разрывов ДНК как основной способ делеции плеча транспозона Основной задачей на данном этапе исследований было выяснить, с какой частотой NHEJ репарация индуцированных двуцепочечных разрывов приводит к появлению делеций, способных нарушить плечо транспозона, фланкирующее трансген. Отказ от SSA репарации в качестве основного механизма удаления плеч неавтономного транспозона позволил упростить конструкцию вектора CTS – в нем была удалена последовательность 3’miniP.

Полученным вектором были трансформированы 150 эмбрионов D. melanogaster. Для дальнейшей работы были отобраны три независимые линии трансгенных мух. С помощью инвертированной ПЦР были установлены точные места встройки трансгенных конструкций в геном.

Рис.1 Схема стабилизации трансгена после его интеграции в геном с помощью CTS –вектора.

скрещивались с самками, несущими трансген с геном I-SceI под контролем промотора гена теплового шока. Потомки этих мух (F1) подвергались тепловому шоку на ранних этапах развития, что индуцировало синтез рестриктазы. В поколении F2 мы наблюдали потерю маркерного гена EGFP. В выборке из всех трансгенных мух мы выделили четыре фенотипических класса по наличию маркерных белков, определяющих окраску глаз Drosophila. В линиях W+ мухи имели оранжевую окраску глаз, что свидетельствовало о нормальной экспрессии гена white. Мухи W– имели белые глаза из-за отсутствия экспрессии гена white. Аналогично, в линии G+ глаза мух имели зеленую флуоресцентную окраску вследствие экспрессии маркерного белка EGFP, у G– флуоресценция отсутствовала (рис. 2).

Более 54% всех трансгенных мух имели фенотип W+G - насекомые потеряли EGFP в результате рестрикции по сайтам ISceI, окружающим маркерный ген. 37,4 % трансгенных эффективностью гидролиза рестриктных сайтов из-за недостатка I-SceI, а также с разновременным характером внесения разрывов и/или быстрой репарации разрывов. В результате, когда происходил гидролиз второго сайта рестрикции, первый был уже Рис. 2. Схема проведения эксперимента сайтгруппе был не только делетирован неспецифической интеграции и NHEJ-зависимой стабилизации трансгенов, где W – ген white, G – ген EGFP, но и получил повреждения EGFP, P – P-элемент. a) трансформация D. melanogaster.

Интеграция трансгена в геном b) отбор трансформантов по фенотипическому проявлению маркеров - white и EGFP. Определение места интеграции трансгена c) введение источника I-SceI в трансгенную линию d) анализ продуктов репарациии, отбор трансгенных мух e) источника транспозазы.

вызвавшему протяженные делеции прилегающих последовательностей ДНК.

Интересна небольшая (2,3%) фенотипическая группа, выявленная только в линии CTS2N, у которой наблюдалась флуоресценция EGFP, но не было экспрессии white.

Механизм образования такой фенотипической группы схож с механизмом образования фенотипа WG, только в случае WG+ репарация дистального разрыва произошла без серьезного изменения окружающей последовательности. Репарация проксимального разрыва, который произошел уже после репарации дистального, произошла с делецией 5’ участка последовательности трансгена, где расположен маркерный ген white. Таким образом, EGFP не был удален, а white потерял свою способность к экспрессии из-за делеции части своей последовательности. Результаты анализа трансгенных мух приведены в табл. 1.

Таблица 1. Результаты анализа трансгенных мух в линиях CTS2107, CTS 5N и CTS 2N. n – число проанализированных мух.

Из всех выделенных фенотипических групп корректно стабилизированные трансгены могли быть только в линии W+G.

Для селекции линий со стабилизированными трансгенами мы использовали известный эффект появления мозаицизма окрашенных глаз у Drosophila вследствие дисгенеза. Перемещение генетической конструкции, содержащей ген white, приводит к появлению потомков (F1), у которых ярко выражена мозаичность глаз.

Для выявления линий со стабилизированными трансгенами, мух с фенотипом W+G из трех исследуемых линий CTS2107, CTS2N и CTS5N скрестили с линией, несущей источник транспозазы. Среди потомков отбирали насекомых с равномерно окрашенными глазами. Наличие мозаичных глаз свидетельствовало о перемещении трансгенной конструкции.

Рис. 3. Доля стабилизированных трансгенов в



Похожие работы:

«НГУЕН ВИНЬ ТИЕН КИНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В СИСТЕМЕ СУБСТРАТ – БИОКАТАЛИЗАТОР – МЕДИАТОР – ЭЛЕКТРОД В БИОТОПЛИВНОМ ЭЛЕМЕНТЕ НА ОСНОВЕ GLUCONOBACTER OXYDANS 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2013 Работа выполнена кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. Научный руководитель : кандидат химических наук, доцент,...»

«Ардельянова Яна Андреевна СОЦИАЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ КОРРУПЦИОННЫХ ОТНОШЕНИЙ: ТЕОРЕТИКО-МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Специальность 22.00.01 – Теория, методология и история социологии Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата социологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре социальной структуры и социальных процессов социологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«ПЛУТНИЦКИЙ АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИОРИТЕТНЫХ НАПРАВЛЕНИЙ РАЗВИТИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ТЕРРИТОРИИ 14.02.03. - общественное здоровье и здравоохранение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2014 Работа выполнена в ФГБУ Национальный НИИ общественного здоровья РАМН Научный консультант : Линденбратен Александр Леонидович доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Зам....»

«Титов Александр Андреевич ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ УГЛУБЛЕНИЙ НА ТЕПЛООБМЕН И СОПРОТИВЛЕНИЕ В ПОТОКЕ СЖИМАЕМОГО ГАЗА Специальность 01.04.14 – Теплофизика и теоретическая теплотехника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2010 2 Работа выполнена в НИИ механики МГУ. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор, академик РАН Леонтьев Александр Иванович Официальные оппоненты : доктор...»

«Тертерян Ашот Владимирович ОЦЕНКА СТОКОРЕГУЛИРУЮЩЕЙ И ПОЧВОЗАЩИТНОЙ СПОСОБНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ЛЕСОВ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА Специальность: 06.01.02 – Мелиорация, рекультивация и охрана земель АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата сельскохозяйственных наук Новочеркасск - 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новочеркасская государственная мелиоративная академия...»








 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.