WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

ЧУРЮМОВА Валерия Александровна

ИЗУЧЕНИЕ Ca2+/РЕКОВЕРИН-ЗАВИСИМОЙ РЕГУЛЯЦИИ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ РОДОПСИНА, КАТАЛИЗИРУЕМОГО

РОДОПСИНКИНАЗОЙ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва – 2008

Работа выполнена в отделе сигнальных систем клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор П.П. Филиппов кандидат химических наук, старший научный сотрудник И.И. Сенин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Е.Н. Иомдина

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится «_» 2008 г. в _ часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» _ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ионы кальция служат универсальным регулятором самых разнообразных процессов, протекающих в живой клетке. Воздействие ионов кальция на эти процессы в большинстве случаев опосредовано Са2+-связывающими белками. За связывание ионов кальция у большинства Са2+-связывающих белков отвечает специальная структура, получившая название “EF-hand”. Многие из белков, содержащих EF-hand-структуру, служат сенсорами ионов кальция для различных мишеней в клетках различных типов, например, в нейронах. Так, в настоящее время известно более сорока представителей EF-hand-содержащих Са2+-связывающих белков, специфичных для нервной ткани, которые составляют семейство нейрональных Са2+-сенсоров (neuronal calcium sensors, NCS). Белки семейства нейрональных Са2+-сенсоров выполняют регуляторную роль в отношении различных внутриклеточных белков-мишеней таких, как: протеинкиназы, гуанилатциклазы, аденилатциклазы и ионные каналы. Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ определяет компартментализацию (раствор/мембрана) многих белков этого семейства, что в свою очередь модулирует их взаимодействие с сигнальными партнерами.

Типичным представителем семейства нейрональных Са2+-сенсоров является рековерин, высокоспецифичный для фоторецепторных клеток сетчатки, представляющих собой высокоспециализированные нейроны. Функция рековерина в фоторецепторной клетке заключается в Са2+-зависимой регуляции десенситизации фотоактивированного рецептора (родопсина) путём его фосфорилирования, катализируемого ферментом родопсинкиназой. При высокой концентрации ионов кальция рековерин находится в комплексе с фоторецепторной мембраной и взаимодействует с родопсинкиназой, что приводит к ингибированию фермента.

Тогда как при низких концентрациях катиона комплекс родопсинкиназа-рековерин диссоциирует и ингибирование снимается. Процесс Са2+-зависимого ингибирования фосфорилирования родопсина происходит на фоторецепторной мембране при непосредственном взаимодействии рековерина и родопсинкиназы.

Актуальность данной работы обусловлена тем, что в настоящее время отсутствует полная информация о механизме Са2+-зависимого взаимодействия рековерина и его внутриклеточной мишени родопсинкиназы, а также роли фосфолипидного матрикса фоторецепторной мембраны в функционировании этих белков.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – изучение механизмов Са2+-зависимой регуляции фосфорилирования родопсина родопсинкиназой. В соответствии с этой целью в работе решались следующие задачи.

• Выявление сайтов родопсинкиназы и рековерина, ответственных за взаимодействие этих двух белков.

• Изучение влияния состава фоторецепторной мембраны на регуляцию фосфорилирования родопсина.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе выявлен участок молекулы родопсинкиназы, принимающий участие во взаимодействии с ее внутриклеточным регулятором рековерином. Установлено, что заполнение Са2+-связывающего центра EF2 рековерина ионами кальция непосредственно контролирует экспонирование гидрофобного “кармана” и миристоильного остатка, и, как следствие, взаимодействие рековерина с его мишенью – родопсинкиназой. Продемонстрировано влияние изменения содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на Са2+-зависимое связывание рековерина с мембранами. Показано, что повышение концентрации холестерина в составе мембран увеличивает способность рековерина ингибировать родопсинкиназу в результате сдвига полумаксимального эффекта ингибирования в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина.



Практическая ценность работы заключается в том, что рековерин является одним из ключевых белков-регуляторов процесса фототрансдукции в фоторецепторной клетке, нарушение которого приводит к целому ряду зрительных патологий. Понимание молекулярных механизмов передачи зрительного сигнала необходимо для разработки эффективных методов лечения заболеваний зрения.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на семинарах отдела сигнальных систем клетки НИИФХБ МГУ, на 7-й Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2003), международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 2005) и на XVIII международной зимней молодежной научной школе “Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии” (Москва, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 4 таблицами. Библиографический указатель включает 209 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Родопсинкиназа, или GRK1, фермент, фосфорилирующий родопсин, представляет собой первую обнаруженную протеинкиназу семейства GRK [Lorenz et al., 1991]. Как и другие представители этого семейства протеинкиназ, родопсинкиназа фосфорилирует только стимулированную (светоактивированную) форму родопсина (Rho*). На основании первичной структуры фермента и гомологии с другими представителями семейства Ser/Thrпротеинкиназ в молекуле родопсинкиназы (RK) выделяют три основных домена: центральный каталитический домен (RK184-454), ограниченный N- и C- концевыми регуляторными доменами (соответственно RK1-183 и RK455-561). С-концевой домен родопсинкиназы содержит СААХ-мотив (CysValLeuSer561), который служит сигналом для присоединения фарнезильной группы к остатку цистеина, и сайты аутофосфорилирования (Ser448, Thr489).

Регуляция родопсинкиназы происходит при участии Са2+-связывающего белка рековерина, специфично экспрессирующегося в клетках сетчатки. Молекула рековерина содержит 4 потенциальных Са2+-связывающих центра типа EF-hand, из которых только два, а именно второй и третий (EF2 и EF3 соответственно) способны связывать ионы кальция. Основными следствиями связывания ионов кальция с рековерином, белком, в котором функционирует “Са2+-миристоильный переключатель” (calcium-myristoyl switch), является: а) экспонирование гидрофобного “кармана” рековерина и б) экспонирование миристоильного остатка, ковалентно присоединенного к N-концевому остатку рековерина. Это придает рековерину способность Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фоторецепторными мембранами и ингибировать его внутриклеточную мишень – родопсинкиназу.

Предыдущие исследования [Klenchin et al., 1995] показали, что ингибирование родопсинкиназы под действием рековерина происходит при непосредственном взаимодействии этих двух белков. Однако механизм этого взаимодействия изучен не был, в частности, оставались неизвестными структурные участки, ответственные за связывание рековерина с его внутриклеточной мишенью. Кроме того, не было исследовано влияние фосфолипидного окружения (состава фоторецепторных мембран) на функционирование рековерина и родопсинкиназы. Используя мутантные формы рековерина и рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, мы попытались ответить на эти вопросы в настоящей работе.

1. Влияние содержания холестерина фоторецепторных мембран на взаимодействие рековерина с мембранами и регуляцию фосфорилирования родопсина.

Большинство процессов, имеющих отношение к фототрансдукции и ее регуляции, происходят непосредственно на мембране. Поэтому в основе обнаруженной способности рековерина ингибировать родопсинкиназную активность может лежать как прямое взаимодействие рековерина с родопсинкиназой, так и механизмы, вовлекающие фоторецепторную мембрану.

Известно, что в мембране фоторецепторных дисков, содержащихся в наружных сегментах палочки (НСП), обнаружена пространственная гетерогенность содержания холестерина. Так, на новообразованные диски у основания НСП (базальные диски) приходится подавляющая часть массы холестерина, что составляет приблизительно 30% от общего количества липидов, в то время как на диски у окончания НСП (апикальные диски) – всего лишь 5% [Boesze-Battaglia et al., 1990]. К моменту начала настоящей работы имелись данные, указывающие на пространственную неоднородность процессов передачи сигнала в НСП. Обнаружено, что ответ на единичный фотон, регистрируемый на конце НСП, имеет меньшую амплитуду, чем ответ, регистрируемый у его основания [Schnapf, 1983]. Можно предположить, что эти различия кинетики фотоответа обусловлены составом фоторецепторной мембраны и, в частности, различным содержанием холестерина.

Для изучения влияния холестерина на регуляцию фосфорилирования светоактивированного родопсина мы получили фоторецепторные мембраны с различным содержанием холестерина: от 4,1 до 29,6%; при том, что нативные мембраны НСП содержат в среднем 14% холестерина. С использованием полученных мембран мы провели измерение влияния содержания холестерина на взаимодействие миристоилированного рековерина с мембранами НСП и фосфолипидными везикулами при насыщающих концентрациях Са2+. (Исследование немиристоилированных форм не проводились, т.к. они с фоторецепторными мембранами не взаимодействуют.) В результате установлено, что с увеличением содержания холестерина от 4,1% до 29,6% количество рековерина, связанного с мембранами НСП, повышается (рис. 1А).

количество связанного рековерина, % Рис. 1. Связывание рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различное количество холестерина.

содержащими фосфатидилэтаноламин (РЕ) и фосфатидилхолин (РС) в соотношении 50:50 с градиентом содержания холестерина (5-50%) при насыщающих концентрациях Са2+. Обнаружено, что связывание рековерина с фосфолипидными везикулами увеличивается при возрастании концентрации холестерина по сравнению с везикулами, не содержащими холестерин (рис. 1Б).

Таким образом, результаты нашего исследования взаимодействия рековерина с фоторецепторными мембранами и фосфолипидными везикулами, содержащими различные концентрации холестерина, позволяют сделать вывод о том, что связывание рековерина с мембранами зависит от содержания в них холестерина.

Для подтверждения полученных результатов по влиянию холестерина на взаимодействие рековерина с мембранами мы использовали альтернативный метод – спектроскопию поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR). С помощью метода SPR мы исследовали влияние холестерина на взаимодействие рековерина с иммобилизованным фосфолипидным бислоем. В этих экспериментах мы использовали систему “рековерин искусственная фосфолипидная мембрана”. В этой системе искусственный липидный бислой образует однородную поверхность на SPR-чипе и присутствует в неподвижной фазе в течение хода эксперимента, в то время как рековерин находится в составе растворимой фазы, подвижной относительно иммобилизованного липидного бислоя.

Для иммобилизации на гидрофобный сенсорный чип мы приготовили смесь фосфолипидов двух типов: а) РЕ и РС (50:50) и б) РЕ, РС и холестерина (25:25:50). Полученные чипы использовали для измерения взаимодействия рековерина с иммобилизованными липидами в присутствии насыщающей концентрации Са2+. При иммобилизации смеси липидов, содержащей холестерин, максимальная амплитуда сигнала связывания возрастала приблизительно в 2 раза по сравнению с сигналом в отсутствие холестерина (рис. 2).

Рис. 2. SPR-сенсограммы, отражающие взаимодействие рековерина с иммобилизованным липидным бислоем. Концентрация СаCl2 составляла 200 мкМ, рековерина – 5 мкM. Полоса над сенсограммами обозначает период времени, в течение которого в подвижной фазе отсутствует (не закрашено) и присутствует (закрашено черным) рековерин.

Варьирование концентрации рековерина в условиях насыщающих концентраций ионов кальция привело к такому же результату: в присутствии холестерина максимальная амплитуда сигнала связывания была в 2 раза выше, чем без него (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость связывания рековерина с иммобилизованным липидным бислоем от концентрации белка. Липидный бислой содержал РЕ:РС в соотношении 50:50 или РЕ:РС:холестерин в соотношении 25:25:50.

Далее мы изучили зависимость ингибирования активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и Са2+ при различных концентрациях холестерина в мембранах НСП.

Полумаксимальная константа ингибирования (K50) родопсинкиназы составила 6,6 мкМ рековерина в присутствии мембран НСП с исходным содержанием холестерина, равным 14%. В то время как в присутствии мембран НСП, содержащих 29,6% холестерина, значение K50 составляло 4,5 мкМ рековерина (таблица 1). Изменение содержания холестерина в мембранах НСП также оказывает влияние на зависимость ингибирования родопсинкиназы от концентрации ионов кальция: при увеличении концентрации холестерина от 4,1% до 29,6% величина K50 для ионов кальция сдвигается в область более низких значений концентрации свободного кальция ([Ca2+]f), а именно уменьшается от 4,31 мкМ до 0,82 мкМ [Ca2+]f (таблица 1).

Таблица 1. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина и свободного кальция при различном содержании холестерина в мембранах.

В настоящее время в литературе широко обсуждается влияние специфических мембранных доменов, нерастворимых в детергенте, (так называемых, рафт-структур) на процессы, имеющие отношение к клеточной сигнализации [Nair et al., 2002]. Рафт-структуры, обнаруженные в НСП, характеризуются высоким содержанием холестерина [Martin et al., 2005].

Наши результаты, демонстрирующие увеличение сродства рековерина к мембранам с повышенным содержанием холестерина, указывают на возможность нахождения рековерина и родопсинкиназы в составе рафт-структур. Поскольку мы показали что, Са2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы усиливается при условии высокого содержания холестерина в мембранах НСП, можно предположить, что этот процесс происходит более эффективно в рафт-структурах, чем в мембранах вне этих структур. Для подтверждения нашего предположения мы сравнили ингибирование активности родопсинкиназы в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур, изолированных из мембран НСП.

представленного на рисунке 4А, следует, что ингибирование родопсинкиназы в присутствии рафт-структур происходит при немного меньших концентрациях рековерина по сравнению с мембранами НСП (К50 = 4,9 мкМ в рафт-структурах и 5,3 мкМ в фоторецепторных мембранах). Однако при исследовании зависимости активности родопсинкиназы от концентрации Ca2+ мы обнаружили существенный сдвиг К50 в сторону низких концентраций Ca2+ в присутствии рафт-структур (рис. 4Б). Это говорит о том, что Ca2+-зависимое ингибирование рековерином фосфорилирования родопсина более эффективно в рафт-структурах по сравнению с нативными фоторецепторными мембранами (К50 = 0,76 мкМ в рафт-структурах и 1,91 мкМ в фоторецепторных мембранах).

относительная активность родопсинкиназы, % Рис. 4. Зависимость активности родопсинкиназы от концентрации рековерина (А) и Са2+ (Б) в присутствии фоторецепторных мембран и рафт-структур.

способствует связыванию рековерина с мембранами и б) холестерин увеличивает эффективность ингибирования активности родопсинкиназы рековерином.

В одной из последних работ по изучению светозависимой транслокации сигнальных белков в фоторецепторной клетке обнаружены факты, указывающие на наличие градиента концентрации рековерина в НСП [Strissel et al., 2005]. В этой работе показано, что более высокая концентрация рековерина присутствует в базальной части НСП, т.е. градиент концентрации рековерина в НСП аналогичен таковому в случае холестерина. В соответствии с нашими данными можно полагать, что именно градиент концентрации холестерина в мембранах НСП обусловливает наблюдаемый градиент концентрации рековерина. Как уже было сказано выше, в НСП существует градиент концентрации холестерина: для базальных дисков до 30%, для апикальных – до 5%. По нашим данным, эффективность ингибирования родопсинкиназной активности рековерином также является гетерогенным процессом, т.к. в базальной части НСП эффективность ингибирующего действия рековерина выше, чем в апикальной области в результате сдвига значения полумаксимального эффекта ингибирования фермента в сторону низких концентраций свободного Са2+ и рековерина. Результаты наших экспериментов, полученные в условиях in vitro, объясняют описанные ранее наблюдения in vivo [Schnapf, 1983] о том, что выключение передачи светового сигнала в базальной части НСП происходит медленнее, чем в их апикальной области.

Исследование роли Са2+-связывающих центров рековерина в ингибировании родопсинкиназы.

К началу настоящей работы в нашей лаборатории были получены две мутантные формы рековерина, у которых не функционировал один из двух работающих в рековерине дикого типа (wt-рековерине) Са2+-связывающих центров (рис. 5). Это – мутант RcE85Q, у которого не функционирует центр EF2 вследствие замены остатка глутаминовой кислоты в 85м положении на остаток глутамина, и мутант RcE121Q, у которого не функционирует центр EF3 из-за аналогичной замены в 121-м положении. В дальнейшем при изучении мутантных форм рековерина с модифицированными Са2+-связывающими центрами было показано, что заполнение Са -связывающих центров катионами происходит последовательно. Сначала заполняется центр EF3 и лишь затем – центр EF2, при этом координация катионов центром EF является необходимым условием для последующего связывания ионов кальция в центре EF2.

Механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция функционирует только в миристоилированном рековерине и не действует в его немиристоилированной форме [Permyakov et al., 2000, Senin et al., 2002].

Рековерин действует как Са2+-сенсор родопсинкиназы, ингибируя ее при относительно высоких концентрациях катиона. Связывание ионов кальция с молекулой рековерина приводит к экспонированию его гидрофобного “кармана”, в результате чего рековерин становится способным взаимодействовать с родопсинкиназой и ингибировать этот фермент [Tachibanaki et al., 2000]. Как уже было сказано выше, молекула рековерина содержит два функционирующих Са2+-связывающих центра, в то же время роль каждого из этих центров в ингибировании родопсинкиназы оставалась неустановленной. Казалось бы, ответ на этот вопрос мог быть получен с использованием мутантов рековерина, один из которых способен связывать ионы кальция во втором Са2+-связывающем центре, а другой – в третьем Са2+связывающем центре. Однако из-за того, что в миристоилированном рековерине функционирует вышеописанный механизм последовательного заполнения Са2+-связывающих центров ионами кальция, миристоилированный мутант RcE121Q с нефункционирующим третьим Са2+связывающим центром ионы кальция вообще не связывает [Senin et al., 2002]. Поскольку в немиристоилированном рековерине связывание ионов кальция с его Са2+-связывающими центрами происходит независимо [Ames et al., 1995], мы попытались ответить на вопрос о роли каждого из двух Са2+-связывающих центров рековерина в экспонировании его гидрофобного “кармана” и, соответственно, в ингибировании родопсинкиназы, используя немиристоилированные формы мутантов рековерина RcE85Q (содержит “испорченный” центр EF2) и RcE121Q (содержит “испорченный” центр EF3).

wt-рековерин мутант RcE85Q мутант RcE121Q Рис. 5. Схема локализации Са2+-связывающих центров в wt-рековерине и его мутантах по второму (мутант RcE85Q) и третьему (мутант RcE121Q) центрам типа EF-hand. Центры, способсвязывать Са2+, обозначены прямоугольниками.

ные ( ) и не способные ( Ранее было показано, что немиристоилированная форма мутанта RcE85Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF2, способна связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF3 [Weiergraber et al., 2003]. Используя радиоактивный изоСа2+, мы показали, что немиристоилированная форма мутанта рековерина RcE121Q, нетоп смотря на то, что в ней присутствует “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3, способна, в отличие от миристоилированной форма этого мутанта, связывать ионы кальция за счет Са2+-связывающего центра EF2 (рис. 6). При этом величина константы диссоциации (KD) для ионов кальция составила 6,4 мкМ, что совпадает со значением KD для Са2+-связывающего центра EF2 в рековерине дикого типа по данным в работе [Ames et al., 1995].

Показателем экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина может служить его способность взаимодействовать с гидрофобным носителем фенилсефарозой [Polans et al., 1991]. В связи с этим мы исследовали связывание немиристоилированных форм мутантов рековерина RcE85Q и RcE121Q и рековерина дикого типа с фенилсефарозой. Исследуемые формы рековерина инкубировали в присутствии суспензии фенилсефарозы в диапазоне [Са2+]f от 10 нМ до 100 мкМ; степень связывания указанных форм рековерина с носителем определяли по количеству белка, оставшегося в растворе после осаждения фенилсефарозы.

Рис. 6. Связывание 45Са2+ с немиристоилированной формой мутанта RcE121Q.

Как было показано ранее [Senin et al., 2002], миристоилированный wt-рековерин Са2+зависимым образом взаимодействует с фенилсефарозой, тогда как миристоилированные мутанты RcE85Q и RcE121Q такой способностью не обладают. Это говорит о том, что оба мутанта в присутствии ионов кальция не экспонируют гидрофобные аминокислотные остатки, необходимые для взаимодействия с гидрофобной матрицей. Используя немиристоилированные формы рековерина, мы показали, что немиристоилированный wt-рековерин способен, подобно миристоилированной форме белка, Са2+-зависимым образом взаимодействовать с фенилсефарозой (рис. 7). Оказалось, что немиристоилированный мутант RcE121Q, несмотря на отсутствие в нем функционального центра EF3, взаимодействует с фенилсефарозой аналогично wt-рековерину. При этом взаимодействие происходит в том же диапазоне [Са2+]f, что и при заполнении катионом нативного Са2+-связывающего центра EF2 в wt-рековерине. В отличие от мутанта RcE121Q, немиристоилированный RcE85Q, хотя и связывает ионы кальция за счет центра EF3, с фенилсефарозой не взаимодействует.

Рис. 7. Са2+-зависимое связывание немиристоилированных форм рековерина с фенилсефарозой.

За 100% принято общее количество рековерина в пробе. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 1,19 мкM, для RcE121Q – 1,48 мкM.

Следовательно, можно сделать вывод, что заполнение ионами кальция центра EF2, но не EF3, определяет способность рековерина взаимодействовать с фенилсефарозой и что координация ионов кальция именно в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для экспонирования гидрофобного “кармана” рековерина. Этот вывод в свою очередь предполагает, что координация ионов кальция в Са2+-связывающем центре EF2 необходима для придания рековерину способности ингибировать родопсинкиназу. Правильность этого предположения подтвердили наши последующие эксперименты по исследованию способности немиристоилированных форм wt-рековерина и мутантов RcE85Q и RcE121Q ингибировать родопсинкиназу Ca2+-зависимым образом.

В этих экспериментах активность родопсинкиназы измеряли по включению радиоактивного фосфата [32Р]-АТФ в родопсин в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной фоторецепторные мембраны, очищенную родопсинкиназу и исследуемые формы рековерина. Концентрацию свободного кальция варьировали в диапазоне от 1 нМ до 100 мкМ. Как следует из рис. 8, немиристоилированный мутант RcE121Q, который содержит “испорченный” Са2+-связывающий центр EF3 и, соответственно, координирует ионы кальция только за счет Са2+-связывающего центра EF2 способен ингибировать родопсинкиназу Са2+зависимым образом. При этом величина K50 по Сa2+ для данного мутанта близка к таковой для wt-рековерина, хотя и несколько сдвинута в область более высоких концентраций ионов кальция. В то же время, немиристоилированный мутант RcE85Q, в котором “испорчен” Са2+связывающий центр EF2 и который координирует ионы кальция только за счет Са2+связывающего центра EF3, не способен ингибировать родопсинкиназу.

относительная активность родопсинкиназы, % Рис. 8. Са2+-зависимое ингибирование активности родопсинкиназы немиристоилированными формами wt-рековерина и мутантами RcE85Q и RcE121Q. За 100% принята активность родопсинкиназы в отсутствие рековерина. Величина K50 для рековерина дикого типа составила 0, мкM, для RcE121Q – 3 мкM.

Таким образом, описанные эксперименты прямо показывают, что именно связывание ионов кальция в Ca2+-связывающем центре EF2 обеспечивают взаимодействие рековерина с родопсинкиназой и ее ингибирование.

3. Выявление сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Биохимические эксперименты на препаратах НСП in vitro продемонстрировали, что рековерин ингибирует фосфорилирование родопсина, взаимодействуя с родопсинкиназой [Klenchin et al., 1995, Senin et al., 2005]. Можно предположить два механизма ингибирования.

Согласно первому механизму, рековерин непосредственно действует на каталитическую активность родопсинкиназы, взаимодействуя с ее каталитическим доменом. Согласно второму, рековерин стерически препятствует формированию фермент-субстратного комплекса родопсинкиназы с фотоактивированным родопсином, не затрагивая активный центр фермента. В предыдущих работах показано, что родопсинкиназа в присутствии рековерина теряет способность фосфорилировать светоактивированный родопсин. При этом рековерин не оказывает влияния на процесс фосфорилирования родопсинкиназой 11-членного пептидного субстрата, гомологичного фрагменту родопсина, который содержит сайты фосфорилирования.

Эти данные предполагают, что рековерин блокирует участок родопсинкиназы, необходимый для узнавания светоактивированного родопсина, не оказывая влияние на каталитическую активность фермента как такового. Рековерин ингибирует родопсинкиназу посредством взаимодействия с участком, удаленным от каталитического центра, следовательно, потенциальными сайтами связывания рековерина могут быть участки, находящиеся в регуляторных N- и C-концевых доменах родопсинкиназы.

Целью настоящего раздела работы было выяснение локализации участков родопсинкиназы, отвечающих за ее взаимодействие с рековерином. Для ответа на этот вопрос нами была получена рекомбинантная родопсинкиназа, а также рекомбинантные фрагменты фермента, соответствующие его N-концевому (RK1-183) и C-концевому (RK455-561) доменам, и изучено их взаимодействие с рековерином.

3.1. Клонирование, идентификация и экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы и фрагментов гена родопсинкиназы.

Исходная конструкция, предположительно содержащая полноразмерный ген родопсинкиназы, была любезно предоставлена доктором М. Ахтаром (Department of Biochemistry, University of Southampton, United Kingdom). На первом этапе работы нами было проведено секвенирование гена и показано, что предоставленная кДНК соответствует гену родопсинкиназы.

Для проведения экспрессии гена родопсинкиназы нами была выбрана система экспрессии под контролем РНК-полимеразы фага Т7, предложенная Студиером [Studier et al., 1986]. С этой целью ген родопсинкиназы клонировали в вектор рТ7-7, содержащий последовательность промотора фага Т7, и трансформировали полученной конструкцией клетки штамма E.coli BL21 (DE3), в хромосоме которых имеется последовательность гена Т7 РНКполимеразы под контролем lac-промотора. Наличие lac-промотра позволяет индуцировать экспрессию гена Т7 РНК-полимеразы и, как следствие, гена, клонированного в рТ7-7, добавлением в культуральную среду синтетического аналога лактозы изопропил--Dтиогалактозида (ИПТГ).

Электрофореграмма экстракта клеток E.coli BL21(DE3) после проведения аналитической экспрессии полноразмерного гена родопсинкиназы, представленная на рис. 9, демонстрирует наличие белка с кажущейся молекулярной массой ~ 67 кДа, соответствующего родопсинкиназе. Уровень экспрессии полноразмерной родопсинкиназы в клетках E.coli, как следует из электрофореграммы, оказался невысоким. Последующие попытки выделения рекомбинантного белка были безрезультатными из-за низкого уровня экспрессии. Вследствие этого для проведения экспериментов нами было принято решение получить рекомбинантные фрагменты родопсинкиназы, соответствующие ее доменам.

Рис. 9. Экспрессия полноразмерного гена родопсинкиназы. Экстракт клеток E.coli BL21(DE3), трансформированных плазмидой pТ7-7-RK, до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

Для получения рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы нами был выбран плазмидный вектор pGEX5x-1 (Amersham Biosciences), содержащий ген глутатион S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) из Schistosoma japonicum. Данная экспрессионная система позволяет проводить экспрессию генов в виде химерных белков, слитых в рамке считывания с глутатион S– трансферазой (GST), что облегчает выделение белков из клеточного экстракта с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном глутатионе [Smith, Johnson, 1988]. Нами были получены генетические конструкции, которые содержат фрагменты гена родопсинкиназы, кодирующие N-концевой домен (pGEX5x-1-N) и С-концевой домен (pGEX5x-1-С), слитые в рамке считывания с геном GST. Экспрессию генов химерных белков проводили в прокариотической системе с использованием штамма E. coli BL21. После индукции экспрессии генов с помощью ИПТГ образование белков анализировали с помощью SDSэлектрофореза экстрактов клеток (рис. 10). Данные, приведенные на рис. 10, указывают на образование рекомбинантных белков с молекулярной массой около 45 кДа и 38 кДа, что соответствует молекулярным массам белков, соответствующих N- и С- концевым доменам родопсинкиназы, экспрессирующимся в одной рамке считывания с GST (GST-N и GST-C).

Уровень экспрессии генов GST-N и GST-C оказался достаточно высоким, но основная часть данных белков накапливалась в форме нерастворимых телец включения. Причиной образования нерастворимых белков может быть как очень высокий уровень экспрессии генов, так и восстановление дисульфидных связей в белках [Lobel et al., 2001]. Для увеличения образования растворимой формы белков нами был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий экспрессии, направленных на уменьшение скорости трансляции по следующим параметрам: температуре роста клеток в диапазоне 20-37С, оптической плотности клеточной культуры в диапазоне А600 от 0,5 до 1 до индукции и времени индукции в диапазоне от 30 минут до 3 часов. Однако любые попытки увеличить выход растворимой формы белка на стадии биосинтеза в бактериальных клетках не привели к успеху – количества растворимого химерного белка не превышали 100 мкг на 1 литр среды, в результате чего выделение химерных белков из клеточного экстракта оказалось невозможным. По этой причине нами было принято решение о выделении рекомбинантных белков GST-N и GST-C из образующихся телец включения. Мы опробовали действие ряда детергентов: Тритона Х-100, Твина-80 и лаурилсаркозина натрия на примере выделения GST-N. При этом было установлено, что наибольшее количество экстрагируемого химерного белка GST-N получается при солюбилизации телец включения в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритона Х-100. Поэтому в дальнейшем мы использовали именно эти детергенты для выделения фрагментов родопсинкиназы, слитых в рамке считывания с GST.

Рис. 10. Экспрессия рекомбинантных генов GST-N и GST-C. Экстракт клеток E.coli BL21, трансформированных плазмидой pGEX5x-1-N (GST-N) и pGEX5x-1-С (GST-C), до индукции ИПТГ (-ИПТГ) и после индукции 0,1 мМ ИПТГ (+ИПТГ). «М» – стандарты молекулярной массы.

С учетом полученных данных нами был разработан и оптимизирован метод получения и выделения химерных белков GST-N и GST-C, продуцируемых E. coli в виде нерастворимых телец включения. Метод состоит из следующих процедур: первая экстракция – удаление растворимых белков в нативных условиях, вторая экстракция – выделение нерастворимых белков в присутствии 1,5% лаурилсаркозина натрия и 2% Тритона Х-100 и последующая очистка химерных белков на иммобилизованном глутатионе. Фракции белков после каждой стадии выделения анализировали методом SDS-электрофореза (рис. 11).

3.2. Выявление доменов и сайтов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином.

Следующим этапом нашей работы было установление доменов родопсинкиназы, ответственных за ее взаимодействие с рековерином. С этой целью мы использовали следующую систему. К суспензии глутатионсефарозы, на которой предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок, содержащий GST, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе, равной 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Затем белки элюировали с помощью 1% SDS и полученные фракции анализировали методом SDSэлектрофореза.

Рис. 11. Выделение и очистка рекомбинантных белков GST-N (А) и GST-C (Б). «М» – стандарты молекулярной массы, «ЭК» – экстракт клеток E.coli BL21, «Р» - фракция растворимых внутриклеточных белков, «Н» – фракция нерастворимых внутриклеточных белков, солюбилизированных в растворе, содержащем 1,5% лаурилсаркозин натрия и 2% Тритон Х-100, «Элюат» – фракция белков после хроматографической очистки на глутатионсефарозе, элюирование 10 мМ глутатионом.

Перед началом исследования взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином с использованием описанной системы, мы провели контрольные эксперименты по изучению взаимодействия GST с рековерином, из которых однозначно следует, что рекомбинантный белок GST сам по себе с рековерином не взаимодействует. Таким образом, данная система может быть использована для изучения взаимодействия белков GST-N и GST-C с рековерином.

Результаты эксперимента по связыванию химерных белков GST-N и GST-C с рековерином представлены на рис. 12. Как видно из представленных данных, N-концевой домен родопсинкиназы в составе химерного белка взаимодействует с рековерином. Напротив, взаимодействия между С-концевым доменом родопсинкиназы и рековерином не наблюдается.

Для более точной локализации участка N-концевого домена родопсинкиназы, вовлеченного во взаимодействие с рековерином, мы провели исследования с использованием синтетических пептидных фрагментов родопсинкиназы RK11-26 и RK2-16. Смысл эксперимента заключался в выяснении способности данных пептидных фрагментов конкурировать с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы за связывание с рековерином. Выбор пептидов обусловлен нашими предварительными результатами, из которых следует, что фрагмент родопсинкиназы 23Asp-471Pro, полученный путем ограниченного протеолиза фарнезилированного белка в присутствии Asp-N-эндопротеиназы, теряет способность взаимодействовать с рековерином. Из этого следует, что во взаимодействие с рековерином вовлечен участок 1-23 регуляторного N-концевого домена родопсинкиназы.

Рис. 12. Взаимодействие химерных белков GST-N и GST-C с рековерином. «М» – стандарты молекулярной массы; «Rc» – очищенный препарат рековерина; «-Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в отсутствие рековерина в инкубационной смеси; «+Rc» – фракция белков элюированных с глутатионсефарозы 1% SDS в присутствии рековерина в инкубационной смеси.

Эксперимент проводили в соответствии со следующей схемой. К суспензии глутатионсефарозы, на которую предварительно иммобилизовали очищенный химерный белок GSTN, добавляли рековерин при конечной концентрации Са2+ в системе 2 мМ. После инкубации реакционной смеси в течение 1 часа при 4С глутатионсефарозу трижды промывали буфером, содержащим 2 мМ CaCl2. Элюирование рековерина проводили одним из трех буферов, содержащих: (а) 1 мМ пептид RK11-26, (б) 1 мМ пептид RK2-16 или (в) 2 мМ Са2+ (в качестве контроля, чтобы исключить неспецифическое элюирование рековерина). Для определения количества рековерина, оставшегося связанным с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы после элюирования в каждом из трех экспериментов, препарат глутатионсефарозы обрабатывали буфером, содержащим 2 мМ ЭГТА.

На рис. 13 представлены результаты по Са2+-зависимому связыванию рековерина с Nконцевым доменом родопсинкиназы в присутствии и в отсутствие пептидных фрагментов родопсинкиназы RK2-16 и RK11-26.

Как следует из рис. 13, рековерин взаимодействует с N-концевым доменом родопсинкиназы в присутствии Са2+ (дорожка 3), тогда как при последующем элюировании буфером, содержащим ЭГТА, рековерин диссоциирует из комплекса с фрагментом родопсинкиназы (дорожка 4). Добавление синтетического пепетида, соответствующего амнокислотным остаткам 11-26 родопсинкиназы (RK11-26), полностью предотвращает взаимодействие рековерина с иммобилизованным N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 7), т.к. последующая обработка ЭГТА не приводит к дополнительному элюированию рековерина (дорожка 8). Однако добавление пептида RK2-16 практически не влияет на взаимодействие между рековерином и N-концевым доменом родопсинкиназы (дорожка 5), о чем свидетельствует значительное количество рековерина во фракции белков после элюции ЭГТА (дорожка 6).

Рис. 13. Конкуренция между химерным белком GST-N и пептидами RK11-26 и RK2-16 за взаимодействие с рековерином.

Таким образом, на основании наблюдаемой в ходе эксперимента конкуренции между фрагментом N-концевого домена RK11-26 и целым N-концевым доменом родопсинкиназы за взаимодействие с рековерином можно заключить, что участок RK11-26 регуляторного Nконцевого домена родопсинкиназы вносит основной вклад во взаимодействие родопсинкиназы и рековерина.

ВЫВОДЫ

1. Сродство рековерина к фоторецепторным мембранам возрастает при увеличении в них концентрации холестерина.

2. Повышение содержания холестерина в фоторецепторных мембранах приводит к уменьшению уровня фосфорилирования содержащегося в них родопсина вследствие усиления Са2+-зависимого ингибирования родопсинкиназы рековерином.

3. Связывание ионов кальция с Ca2+-связывающим центром рековерина EF2, но не EF3, обусловливает экспонирование неполярных боковых цепей гидрофобного “кармана” белка и тем самым – Ca2+-зависимое ингибирование родопсинкиназы.

4. За взаимодействие родопсинкиназы с рековерином отвечает регуляторный Nконцевой домен фермента, причем основной вклад вносит ее фрагмент RK11-26.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ваганова С.А., Сенин И.И., Чурюмова В.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Липкин В.М., Косh K.-W. Механизм Са2+-зависимого ингибирования рековерином фосфорилирования светоактивированного родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Тезисы докладов VI чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва - Пущино, 25 ноября – 2 декабря, 2002, с.78.

2. Чурюмова В.А., Ваганова С.А., Зинченко Д.В., Заргаров А.А., Сенин И.И. Белковый дизайн Са2+-связывающего белка рековерина: создание искусственного кальций-связывающего участка в молекуле рековерина. Тезисы докладов 7-й Пущинской конференции молодых ученых. Пущино, 14-18 апреля, 2003, с. 3. Senin I.I., Hoppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergentresistant membrane rafts from rod outer segments. J. Biol. Chem. 2004; v. 279 (47); p.

48647-53.

4. Senin I.I., Hoeppner-Heitmann D., Polkovnikova O.O., Churumova V.A., Tikhomirova N.K., Philippov P.P., and Koch K.-W. Recoverin and rhodopsin kinase activity in detergent-resistant membrane rafts from rod outer segments. 8th European symposium on calcium binding proteins in normal and transformed cells. Cambridge, UK, 30 July - August, 2004, p. 83.

5. Komolov K.E., Zinchenko D.V., Churumova V.A., Vaganova S.A., Weiergraber O.H., Senin I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. One of the Ca2+ binding sites of recoverin exclusively controls interaction with rhodopsin kinase. Biol. Chem. 2005; v. 386 (3); p. 285Чурюмова В.А., Комолов К.Е., Сенин И.И., Филиппов П.П., Koch K.-W. Роль Са2+связывающих центров рековерина в Са2+-зависимой регуляции родопсинкиназы.

Тезисы докладов международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 6 – 9 июня, 2005, с. 220-222.

7. Чурюмова В.А., Сенин И.И., Hоeppner-Heitmann D., Тихомирова Н.К., Филиппов П.П., Koch K-W. Изучение влияния содержания холестерина в составе фоторецепторных мембран на процесс фосфорилирования родопсина, катализируемый родопсинкиназой. Тезисы докладов XVIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 7 – 10 февраля, 2006, с.70.

8. Weiergraber O.H., Senin I.I., Zernii E.Y., Churumova V.A., Kovaleva N.A., Nazipova A.A., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Philippov P.P., Granzin J., Koch K.-W. Tuning of a neuronal calcium sensor. J. Biol. Chem. 2006; v. 281 (49); p. 37594-37602.

9. Senin I.I., Churumova V.A., Philippov P.P., Koch K.-W. Membrane binding of the neuronal calcium sensor recoverin - modulatory role of the charged carboxy-terminus. BMC Biochem. 2007; v. 22; p. 24.

10. Komolov K.E., Senin I.I., Kovaleva N.A., Christoph M., Churumova V.A., Grigoriev I.I., Philippov P.P., Koch K.-W. Mechanism of rhodopsin kinase regulation by recoverin. 13th International conference on retinal proteins. Barcelona, June 15 – 19, 2008, p.





Похожие работы:

«ХОЛОДНЮК ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА РОЛЬ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПСИХОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ШКОЛЬНИКОВ В ПРОЦЕССЕ АДАПТАЦИИ К УСЛОВИЯМ ПРЕДПРОФИЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ И ПРОФИЛЬНОГО ОБУЧЕНИЯ Специальность 19.00.02 – Психофизиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2009 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных и валеологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет доктор биологических наук, доцент Научный...»

«ПЕРЕКАЛИНА Марина Владимировна КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ СУПРАПИЩЕВОДНЫХ СИНДРОМОВ ГАСТРОЭЗОФАГЕАЛЬНОЙ РЕФЛЮКСНОЙ БОЛЕЗНИ 14.01.04 – внутренние болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Ставрополь – 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Ставропольская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Пасечников...»

«КУДИНОВ Владимир Валерьевич ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ КАК СРЕДСТВО РЕАЛИЗАЦИИ ЭМПИРИЧЕСКОГО ПОЗНАНИЯ ПРИ ОБУЧЕНИИ ФИЗИКЕ В 5-6 КЛАССАХ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (физика, уровень общего образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск – 2011 Работа выполнена на кафедре теории и методики обучения физике ФГБОУ ВПО Челябинский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор...»

«Титов Александр Андреевич ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОВЕРХНОСТНЫХ УГЛУБЛЕНИЙ НА ТЕПЛООБМЕН И СОПРОТИВЛЕНИЕ В ПОТОКЕ СЖИМАЕМОГО ГАЗА Специальность 01.04.14 – Теплофизика и теоретическая теплотехника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2010 2 Работа выполнена в НИИ механики МГУ. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор, академик РАН Леонтьев Александр Иванович Официальные оппоненты : доктор...»

«Верхоглазова Елена Викторовна ДИАГНОСТИКА ГЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЕТОДАМИ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Специальность: 03.01.01 - радиобиология Москва - 2012 2 Работа выполнена на кафедре физики ускорителей и радиационной медицины физического факультет МГУ имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Пирогов Юрий Андреевич Официальные оппоненты :...»

«БУКШУК НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИЧНЫХ ГУБОК ОЗЕРА БАЙКАЛ: РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ЖИЗНЕННЫЕ ЦИКЛЫ 03.02.08 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск – 2014 Работа выполнена в Лаборатории биологии водных беспозвоночных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Лимнологический институт Сибирского отделения Российской академии наук (ЛИН СО РАН), г. Иркутск. Научный доктор биологических...»

«Ветров Андрей Алексеевич РАСЧЕТ ЭЛЕКТРОДИНАМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И ОПТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ УСКОРЯЮЩИХ СТРУКТУР В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН Специальность 01.04.20 Физика пучков заряженных частиц и ускорительная техника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2005 Работа выполнена в отделе...»

«Чжао Вэньцзе ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ ТЕКСТА ГАЗЕТНОЙ ЗАМЕТКИ Специальность 10.02.01 - русский язык Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Москва 2007 Работа выполнена в Отделе корпусной лингвистики и лингвистической поэтики Института русского языка им. В.В. Виноградова РАН. Научный руководитель : доктор филологических наук Фатеева Наталья Александровна Официальные...»

«Кучина Елена Викторовна СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОТРАВЛЕНИЙ НЕКОТОРЫМИ СУРРОГАТАМИ АЛКОГОЛЯ 14.00.24. – судебная медицина Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 2 Работа выполнена в танатологическом отделе Федерального государственного учреждения Российский центр судебно-медицинской экспертизы Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор...»

«Кузнецов Дмитрий Владимирович Развитие методов исследования процессов в узлах крепления сердечников статоров к корпусам турбогенераторов и совершенствование их диагностики в условиях эксплуатации Специальности: 05.14.02 - “Электростанции и электроэнергетические системы” 05.09.01 - “Электромеханика и электрические аппараты” Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2009 г. 2 Работа выполнена в филиале ОАО НТЦ электроэнергетики -...»

«МИКЕРИНА АЛЕНА СЕРГЕЕВНА ПОЗНАВАТЕЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ДЕТЕЙ ДОШКОЛЬНОГО ВОЗРАСТА В ИНТЕГРИРОВАННОМ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОМ ПРОЦЕССЕ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (дошкольное образование) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Челябинск – 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Челябинский государственный педагогический университет Научный...»

«ТУРЛЮН ВИКТОР ИВАНОВИЧ ПРОДУКТИВНЫЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АЙРШИРСКОГО СКОТА В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ 06.02.10 – частная зоотехния, технология производства продуктов животноводства АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар - 2010 2 Работа выполнена на кафедре технологии животноводства ФГОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заслуженный...»

«Тимофеев Сергей Александрович Модельное изучение динамики инфляции, гравитации и космологической постоянной Специальность 01.04.02 – Теоретическая физика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Долгопрудный 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Московский физико-технический институт...»

«ВАРКЕНТИН Андрей Владимирович ПОСТВАКЦИНАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ К ГРИППУ У РАЗНЫХ ВИДОВ ДОМАШНИХ ПТИЦ 06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Владимир – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГБУ ВНИИЗЖ), г. Владимир Научный руководитель – доктор...»

«ЧУДАКОВА Наиля Муллахметовна КОНЦЕПТУАЛЬНАЯ ОБЛАСТЬ НЕЖИВАЯ ПРИРОДА КАК ИСТОЧНИК МЕТАФОРИЧЕСКОЙ ЭКСПАНСИИ В ДИСКУРСЕ РОССИЙСКИХ СРЕДСТВ МАССОВОЙ ИНФОРМАЦИИ (2000 – 2004 гг.) 10. 02. 01. – русский язык АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук Екатеринбург – 2005 Работа выполнена в ГОУ ВПО Уральский государственный педагогический университет Научный руководитель : Заслуженный деятель науки РФ, доктор филологических наук, профессор...»

«Кохичко Андрей Николаевич ТЕОРИЯ И МЕТОДИКА ЛИНГВООРИЕНТИРОВАННОГО ОБРАЗОВАНИЯ МЛАДШИХ ШКОЛЬНИКОВ 13.00.02 – теория и методика обучения и воспитания (русский язык, уровень начального образования), педагогические наук и АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Челябинск – 2012 2 Работа выполнена на кафедре дошкольного и начального образования в государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального...»

«БОРИСОВА Елена Анатольевна ОЦЕНКА РЕКРЕАЦИОННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПОЧВЕННОРАСТИТЕЛЬНОГО ПОКРОВА ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ УДМУРТИИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2013 Работа выполнена на кафедре инженерной защиты окружающей среды ФГБОУ ВПО Удмуртский государственный университет Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент Кургузкин Михаил Георгиевич...»

«ЧЕСТНОВ ОЛЕГ ПЕТРОВИЧ НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СТРАТЕГИЧЕСКИХ НАПРАВЛЕНИЙ МЕЖДУНАРОДНОГО СОТРУДНИЧЕСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ С ВСЕМИРНОЙ ОРГАНИЗАЦИЕЙ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ 14.00.33 – Общественное здоровье и здравоохранение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2008 г. 2 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Центральный научно-исследовательский институт организации и информатизации здравоохранения Федерального...»

«Жаркая Варвара Юрьевна СПЕЦИФИКА РАБОТЫ С ИСТОЧНИКАМИ ВО “ВСЕМИРНОЙ ХРОНИКЕ” МИХАИЛА ГЛИКИ: ТВОРЧЕСТВО КОМПИЛЯТОРА Специальность 10.02.14 – классическая филология, византийская и новогреческая филология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата филологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Институте Высших Гуманитарных Исследований Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российский...»

«БУЛИН-СОКОЛОВА Елена Игоревна НАУЧНО-ПЕДАГОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ИНФОРМАТИЗАЦИИ ОБЩЕГО ОБРАЗОВАНИЯ 13.00.02 - Теория и методика обучения и воспитания (информатизация образования) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора педагогических наук Москва 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии образования Институт содержания и методов обучения Научный консультант : академик РАО, доктор педагогических наук, профессор Кузнецов Александр...»






 
2014 www.av.disus.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.